非小細胞肺癌患者缺氧誘導因子、血管內皮細胞生長因子表達水平及其臨床意義

賀春艷，吳月明

(錦州醫科大學附屬第三醫院腫瘤二科，遼寧 錦州 121001)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中的常見類型，所占比例高達80%，且大多數患者在就診時已處于疾病中晚期，5年的總體生存率較低，對患者預后的影響較大[1-2]。因此，積極的了解NSCLC的確切發病機制，在早診斷、早治療疾病、改善預后方面占據著重要地位。缺氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，HIF)是調節機體缺氧環境的重要指標，其中HIF-1α、HIF-2α是作用最為重要的兩種因子，目前的較多研究已證實，HIF-1α在惡性腫瘤中有著廣泛價值，可促使腫瘤細胞增殖、生長[3-4]。然而關于HIF-2α在惡性腫瘤中的相關作用報道較少。血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial cell growth factor，VEGF)是機體血管生成的重要指標，可促使毛細血管新生，增加腫瘤組織的灌注情況，造成腫瘤細胞周期紊亂，從而影響患者預后[5]。因此，本研究旨在探討NSCLC患者HIF-2α、VEGF的表達水平及其臨床意義，旨在為臨床診療提供一定參考依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年3月至2021年11月我院接診的86例NSCLC患者作為本研究對象。病例納入標準：①符合NSCLC相關診斷標準，并通過影像學、纖維支氣管鏡病理學檢查、病理組織學檢查等確診[6]；②病歷資料完整；③簽署研究知情同意書。排除標準：①已接受過放化療；②同時伴有其他惡性腫瘤；③合并結締組織性疾病、風濕性疾病、強直性脊柱炎等；④長期服用免疫抑制劑或伴有自身免疫性疾病；⑤伴有其他組織器官功能嚴重衰竭；⑥伴有精神疾患。86例中男58例,女28例，年齡47～78歲，平均(62.22±7.10)歲；腫瘤直徑≥5 cm 42例、<5 cm 44例；TNM分期Ⅰ期14例、Ⅱ期28例、Ⅲ期29例、Ⅳ期15例；分化程度：低分化20例、中分化51例、高分化15例；有淋巴結轉移36例、無淋巴結轉移50例。本研究已通過我院倫理委員會批準實施。

1.2 標本采集及HIF-2α、VEGF檢測方法 收集所有患者的NSCLC組織標本及癌旁組織(距腫瘤病灶邊緣>3 cm的組織)標本，使用4%中性福爾馬林溶液固定標本，常規石蠟包埋，連續性4 μm厚度進行切片，脫水處理后，使用乙二胺四乙酸(EDTA)予以抗原修復，加入蒸餾水10 μl、10%過氧化氫5 μl，置于室溫條件下，孵育30 min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行3次洗滌，每次洗滌時間3 min；分別加入HIF-2α、VEGF單克隆抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)，置于37 ℃條件下，孵育60 min，PBS進行3次洗滌，每次洗滌時間3 min；加入經過辣根過氧化物酶(HRP)標記的HIF-2α、VEGF二抗，置于37 ℃條件下，孵育20 min，PBS進行3次洗滌，每次洗滌時間3 min，再加入二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色處理，PBS沖洗、復染，脫水處理后進行觀察結果。

1.3 HIF-2α、VEGF陽性率判定方法 在顯微鏡下進行觀察，隨機選擇5個400倍視野，根據HIF-2α、VEGF著色強度和陽性細胞所占比例判定，其中著色為褐色、黑色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，無色記1分，陽性細胞所占比例≥75%記4分，陽性細胞所占比例<75%且≥51%記3分，陽性細胞所占比例<51%且≥11%記2分，陽性細胞所占比例<11%則記1分，無陽性細胞則記0分，將兩者結果相乘，總分≥3分則判定為陽性表達，<3分則為陰性表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，計數資料以[例(%)]表示，比較采用χ2檢驗，HIF-2α和VEGF的相關性采用Spearman等級分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC組織和癌旁組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率比較 NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率均明顯高于癌旁組織，比較差異有統計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC組織和癌旁組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率比較[例(%)]

2.2 不同臨床病理NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率比較 HIF-2α、VEGF在不同性別、年齡中的陽性表達率比較差異無統計學意義(均P>0.05)，腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移患者的HIF-2α、VEGF陽性表達率明顯高于腫瘤直徑<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移患者，比較差異有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率比較[例(%)]

續 表

2.3 HIF-2α和VEGF相關性分析 經過Spearman等級相關性分析顯示，HIF-2α和VEGF之間呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 HIF-2α和VEGF相關性分析(例)

3 討 論

隨著人們生活習慣的不斷改變，NSCLC已在臨床上呈現出較高的發病率及病死率，極大的影響著患者的預后，早期接受手術切除病灶是治愈患者的重要方案，但NSCLC的早期癥狀不明顯，多數患者在醫院就診時已處于病情中晚期，喪失了根治性切除手術機會。而積極了解NSCLC的發病機制在指導臨床治療、改善預后方面顯得十分重要[7-8]。

國內外均有研究顯示，缺氧是實體腫瘤惡性增殖過程中十分常見的現象，也是促使腫瘤進展的一種重要生理改變，主要是由于腫瘤細胞會營造一種低氧環境，并刺激白細胞介素-6、轉化生長因子等細胞因子分泌，再通過一系列途徑發揮促進腫瘤生長、增殖、轉移等作用，最終導致疾病惡化[9-10]。HIF是一種人體中普遍存在的轉錄因子，其表達主要受到細胞外氧分壓的調控，是反映機體缺氧程度的重要指標，既往的研究多著重于HIF-1α在腫瘤組織中的作用[11-12]。但關于HIF-2α的報道較為欠缺，HIF-2α主要作用是主導著機體的慢性缺氧情況，主要表達于血管內皮細胞、肺泡Ⅱ細胞、巨噬細胞等中，而近年來關于其在惡性腫瘤中的作用也備受學者重視，我國有研究顯示，HIF-2α基因單核苷酸多態性和胃癌易感性之間存在著密切聯系[13]。國外有相關報道也發現，HIF-2α對腫瘤微環境也具有調節作用，參與著惡性腫瘤的發生及發展等過程[14]。此外，新生血管生成也是腫瘤發生、發展的重要環節，和腫瘤浸潤、轉移密切相關，VEGF是評價機體血管生成的重要指標，除具有促進血管生成的作用之外，還能夠加強血管側枝循環的建立功能，損傷血管內皮細胞，從而促使腫瘤進展。目前的較多報道也發現，VEGF在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中均有著高表達的陽性率，且和淋巴結轉移等不良預后有著明顯相關性[15-16]。

本研究通過觀察發現，NSCLC組織中HIF-2α、VEGF陽性表達率明顯高于癌旁組織，且在中瘤直徑≥5 cm、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移患者中，HIF-2α、VEGF陽性表達率也明顯高于腫瘤直徑<5 cm、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無淋巴結轉移的患者，結果存在著明顯差異。通過分析是由于，腫瘤組織持續性的處于一種慢性缺氧環境下，此過程會逐漸增加HIF-2α的表達，導致腫瘤組織中HIF-2α陽性率出現明顯升高；Albadari 等[17]研究也顯示，HIF-2α可通過上調一些促癌基因的表達，在腫瘤細胞適應低氧環境中發揮著重要作用；另也有相關文獻表明，HIF-2α除能反映缺氧狀況之外，也具有誘導腫瘤血管生成、調控血管功能的作用[18]。此外，腫瘤細胞的生長會依賴于血管的滋養供應，隨著VEGF表達升高，新生血管的增加，可進一步加強腫瘤細胞的浸潤、轉移能力，促使腫瘤組織血流動力學紊亂，最終導致腫瘤進展，影響患者預后。雷蕓等[19]實驗中也證實，NSCLC組織中VEGF的陽性表達率為72.22%，和本研究中的69.77%結果相近，且該研究中也顯示出VEGF和患者TNM分期、淋巴結轉移等密切相關。

本研究通過進一步相關性分析也顯示，HIF-2α和VEGF之間呈明顯的正相關，主要原因分析如下，腫瘤發生后組織會出現缺氧情況，在缺氧狀態下會啟動血管生成反應，而隨著新生血管的生成，組織缺氧現象會隨之加重，兩者之間有著相輔相成的作用，形成一種惡性循環，共同促進了NSCLC患者病情的進一步進展。近年來，臨床上逐漸開展了較多以抗VEGF為靶點治療的研究，也取得了較好的成效[20-21]，而和HIF-2α相關的靶點研究報道仍較少，但本研究也為今后臨床治療NSCLC的靶向治療提供了一個新的方向，筆者也認為，今后在NSCLC患者的診治中，可通過檢測HIF-2α、VEGF表達來評估患者預后，也有利于早期開展相關治療。但是本研究也存在不足，例如未能分析兩者與患者預后、治療效果、生存率方面的影響等，且總體樣本量較少、樣本來源單一，今后也有待開展更高質量的研究。

綜上所述，NSCLC組織中HIF-2α、VEGF表達明顯升高，且和腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移之間密切相關，臨床上應予以重視，本研究也為今后臨床靶向治療NSCLC提供了新思路。