酶聯(lián)免疫法測(cè)定水產(chǎn)苗種中氯霉素殘留量

梁娟，張倩玉，魏海英，王芳，安萍，王磊

（日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276826）

氯霉素（chloramphenicol,CAP）作為廣譜抗生素，因其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，且對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性菌等多種病原菌均有較強(qiáng)的預(yù)防與治療作用，曾經(jīng)被水產(chǎn)行業(yè)作為苗種繁育和提高養(yǎng)殖產(chǎn)量的“法寶”。但是，經(jīng)研究證明，含有氯霉素的食物被人類長(zhǎng)期食用后，會(huì)導(dǎo)致再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥、毒血癥等疾病發(fā)生，即使低濃度藥物殘留也會(huì)誘發(fā)致病菌的耐藥性，對(duì)人體的毒副作用較大。因此，氯霉素已被大多數(shù)國(guó)家明令禁止在人類可食用的動(dòng)物源性食品中使用。《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號(hào)》中規(guī)定，氯霉素在所有食品動(dòng)物中禁止檢出。

關(guān)于氯霉素的檢測(cè)方法，氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等大型儀器分析方法，靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為藥物殘留檢測(cè)的確認(rèn)方法。然而，水產(chǎn)苗種的繁育季節(jié)性強(qiáng)、周期短，苗種今天被抽檢，明天被銷售的情況屢見(jiàn)不鮮，大型儀器分析方法前處理過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果滯后，是水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管部門執(zhí)法時(shí)所面臨的棘手問(wèn)題，成為執(zhí)法工作時(shí)效性的制約因素。因此，含有氯霉素的水產(chǎn)苗種很容易流向市場(chǎng)，成為漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管工作中的“漏網(wǎng)之魚(yú)”，而酶聯(lián)免疫法檢測(cè)氯霉素技術(shù)可以有效地解決這一問(wèn)題，成為執(zhí)法部門的有力抓手。

目前使用最普遍的酶聯(lián)免疫法分析技術(shù)與大型儀器分析方法相比，除具備對(duì)人體傷害和環(huán)境污染危險(xiǎn)性小、檢出限低、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低等優(yōu)點(diǎn)外，操作簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)結(jié)果及時(shí)、可提高執(zhí)法工作的時(shí)效性更成為大型儀器分析法所不具備的優(yōu)勢(shì)，是目前最理想的氯霉素殘留篩選性分析方法之一。日照市海洋與漁業(yè)研究院綜合檢測(cè)中心用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)水產(chǎn)苗種中氯霉素殘留量取得了一定的操作經(jīng)驗(yàn)，已獲得“CMA”和“CATL”資質(zhì)，得到山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局和山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳等監(jiān)管部門的官方認(rèn)可。現(xiàn)將試驗(yàn)情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

MK3微孔板酶標(biāo)儀、微量移液器、多道微量移液器（賽默飛世爾科技有限公司）；PL202-L電子精密天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；TG16-WS2臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；渦旋混合器（美國(guó)Talboys公司）；DC-24水浴氮吹儀（上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司）；10 D經(jīng)濟(jì)型純水儀（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；DNP-9002BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；BCD-215KS海爾電冰箱（青島海爾股份有限公司）；-10～50℃、10%～90%RH溫濕度表（北京康威儀表有限責(zé)任公司）；JYL-C022九陽(yáng)料理機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）。

1.2 化學(xué)試劑

96孔氯霉素檢測(cè)試劑盒（美國(guó)柏爾生物技術(shù)公司）；去離子水；分析純乙酸乙酯（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；分析純正己烷（天津科密歐試劑有限公司）。

1.3 樣品前處理

日照市海洋與漁業(yè)研究院綜合檢測(cè)中心提供給國(guó)家北方蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照站、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)刺參產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照綜合試驗(yàn)站和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)魚(yú)類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系日照東港綜合試驗(yàn)站氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，委托其用聚乙烯桶分別培育中國(guó)對(duì)蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種和牙鲆苗種的陽(yáng)性樣本作為試驗(yàn)對(duì)象，空白樣品的樣本亦由其提供。開(kāi)始試驗(yàn)前，挑出樣品中餌料等雜質(zhì)，用去離子水清洗、瀝干，用九陽(yáng)料理機(jī)攪碎成糜狀，充分混合均勻，放入冰箱2～6℃冷藏待檢。

1.4 氯霉素的提取

準(zhǔn)確稱取糜狀樣品（3.00±0.01)g置于25 mL聚丙烯離心管中，質(zhì)控樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定加標(biāo)回收率，50℃孵育30 min；加入6 mL乙酸乙酯，以最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩5 min，室溫（22.5±2.5）℃，4 000 r/min離心10 min；移取4 mL乙酸乙酯上清液（相當(dāng)于2.00 g原始樣品），置于10 mL聚丙烯離心管中，60～70℃水浴氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.5 樣品凈化

加入2.00 mL正己烷溶解干燥物，加入1.00 mL 1倍的樣品提取液，最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩2 min；室溫（22.5±2.5）℃，4 000 r/min離心10 min，去除上層正己烷層，下層溶液供酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 試驗(yàn)方法

移取標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品上機(jī)液100μL，置于對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板孔中；再按以上順序加入50μL CAPHRP，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，室溫（22.5±2.5）℃避光孵育30 min；小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔及時(shí)加入洗滌液250μL，輕輕振蕩混勻1 min，將孔內(nèi)液體甩干，重復(fù)洗板步驟3次，每次間隔10 s，在吸水紙上倒扣、排干（排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干）；每酶標(biāo)板孔加入100μL的底物（TMB Substrate），輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，室溫（22.5±2.5）℃避光孵育15～20 min；每酶標(biāo)板孔加入100μL的終止液終止反應(yīng)，輕輕振蕩混勻1 min，供上機(jī)測(cè)定。在上機(jī)前40～60 min打開(kāi)酶標(biāo)儀，使儀器狀態(tài)穩(wěn)定，并將測(cè)試波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm。

1.7 方法優(yōu)化

在動(dòng)物體內(nèi)，氯霉素（CAP）不只是以游離形式存在，葡萄糖酸苷結(jié)合物（CAPG）是其最主要的代謝物形式。若直接用乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行提取，只能提取出游離態(tài)氯霉素，方法靈敏度降低。為提高方法靈敏度并防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需要對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，通過(guò)升溫孵育將結(jié)合鍵破壞，以提高氯霉素檢出濃度。為驗(yàn)證優(yōu)化改進(jìn)的可行性，該試驗(yàn)采取直接提取和升溫孵育提取。將各試驗(yàn)站提供的4種不同基質(zhì)陽(yáng)性樣品各稱取2組，每組3管，分別設(shè)置直接提取和50℃孵育30 min后提取2種方法條件，以驗(yàn)證優(yōu)化改進(jìn)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取劑對(duì)樣品的影響

美國(guó)柏爾生物技術(shù)公司生產(chǎn)的氯霉素檢測(cè)試劑盒，提供了乙酸乙酯和乙腈2種氯霉素提取方法，但考慮到對(duì)人體的危害性和環(huán)境的污染性來(lái)說(shuō)，乙腈比乙酸乙酯毒性大，再加上馬永飛等比較了3種不同的提取劑（乙腈、乙酸乙酯和水）對(duì)CAP提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，提取效果優(yōu)于乙腈和水。因此，該試驗(yàn)選用乙酸乙酯作為氯霉素提取試劑。

2.2 升溫孵育對(duì)檢出濃度的影響

升溫孵育對(duì)氯霉素殘留檢出濃度的影響情況見(jiàn)表1。表1結(jié)果顯示，50℃孵育30 min后提取，氯霉素殘留的平均檢出濃度明顯得到提高，平均提高率為12.4%～13.8%，由此可見(jiàn)，升溫孵育適用于氯霉素的提取，故該試驗(yàn)將直接提取優(yōu)化為升溫孵育提取。

表1 升溫孵育對(duì)氯霉素殘留檢出濃度的影響

2.3 線性范圍及檢出限

大型儀器分析法和酶聯(lián)免疫法的線性范圍見(jiàn)表2 ，大型儀器分析法和酶聯(lián)免疫法的檢出限與定量限見(jiàn)表3。與文獻(xiàn)[10-11]中推薦的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜法相比，酶聯(lián)免疫法檢出限較低、靈敏度較高（表2、表3），可以對(duì)樣本中氯霉素殘留濃度進(jìn)行定量判斷。

表2 大型儀器分析法和酶聯(lián)免疫法的線性范圍

表3 大型儀器分析法和酶聯(lián)免疫法的檢出限與定量限

2.4 加標(biāo)回收率與精密度（RSD）

對(duì)食品中禁用藥物，回收率應(yīng)在方法檢測(cè)下限、2倍方法檢測(cè)下限和10倍方法檢測(cè)下限進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。選取4種不同基質(zhì)的氯霉素陰性樣品，分別做樣品添加濃度為0.025，0.050，0.250μg/kg的3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（表4）。與大型儀器分析法的自動(dòng)進(jìn)樣方式不同，酶聯(lián)免疫分析法是手動(dòng)進(jìn)樣。操作可調(diào)試移液器采用“吸二打一”的手法，可縮小偶然誤差、增加微量進(jìn)樣的穩(wěn)定性、確保精密度并提高加標(biāo)回收率。

表4 不同基質(zhì)、不同加標(biāo)水平的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

由表4可見(jiàn)，酶聯(lián)免疫法回收率高、重復(fù)性好，蝦、蟹、參、魚(yú)各種基質(zhì)苗種平均回收率測(cè)定為71.2%～113.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定為3.3%～9.2%，符合“70%≤加標(biāo)回收率≤120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤10%”的質(zhì)量控制規(guī)定，且靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)0.025μg/kg，在0.05μg/kg的低加標(biāo)水平下，回收率依然可達(dá)70%～120%的質(zhì)控范圍，能滿足為水產(chǎn)品質(zhì)量安全執(zhí)法部門篩選陽(yáng)性樣品的要求。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法的缺點(diǎn)是影響因素較多，易出現(xiàn)大量假陽(yáng)性結(jié)果，抗體批次不同，測(cè)定結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)差異，但靈敏快捷、高精密度且簡(jiǎn)便易行是酶聯(lián)免疫法在藥物殘留分析方法中的最大優(yōu)勢(shì)。多年來(lái)，日照市海洋與漁業(yè)研究院綜合檢測(cè)中心一直承擔(dān)著市級(jí)水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全監(jiān)督抽查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)任務(wù)，為市級(jí)漁業(yè)主管部門的管理工作和執(zhí)法檢查提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。在實(shí)際檢測(cè)工作中，不可能也無(wú)必要對(duì)所有水產(chǎn)苗種采用各種復(fù)雜、耗時(shí)、昂貴的大型儀器分析方法，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易行的酶聯(lián)免疫分析法，及時(shí)為管理部門提供執(zhí)法依據(jù)。