酶聯免疫法測定水產苗種中氯霉素殘留量

梁娟，張倩玉，魏海英，王芳，安萍，王磊

（日照市海洋與漁業研究院，山東 日照 276826）

氯霉素（chloramphenicol,CAP）作為廣譜抗生素，因其生產工藝簡單、價格低廉，且對革蘭陰性和陽性菌等多種病原菌均有較強的預防與治療作用，曾經被水產行業作為苗種繁育和提高養殖產量的“法寶”。但是，經研究證明，含有氯霉素的食物被人類長期食用后，會導致再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥、毒血癥等疾病發生，即使低濃度藥物殘留也會誘發致病菌的耐藥性，對人體的毒副作用較大。因此，氯霉素已被大多數國家明令禁止在人類可食用的動物源性食品中使用。《中華人民共和國農業農村部公告 第250號》中規定，氯霉素在所有食品動物中禁止檢出。

關于氯霉素的檢測方法，氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等大型儀器分析方法，靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法。然而，水產苗種的繁育季節性強、周期短，苗種今天被抽檢，明天被銷售的情況屢見不鮮，大型儀器分析方法前處理過程耗時較長，檢測結果滯后，是水產品質量安全監管部門執法時所面臨的棘手問題，成為執法工作時效性的制約因素。因此，含有氯霉素的水產苗種很容易流向市場，成為漁業質量安全監管工作中的“漏網之魚”，而酶聯免疫法檢測氯霉素技術可以有效地解決這一問題，成為執法部門的有力抓手。

目前使用最普遍的酶聯免疫法分析技術與大型儀器分析方法相比，除具備對人體傷害和環境污染危險性小、檢出限低、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低等優點外，操作簡便、快速、檢測結果及時、可提高執法工作的時效性更成為大型儀器分析法所不具備的優勢，是目前最理想的氯霉素殘留篩選性分析方法之一。日照市海洋與漁業研究院綜合檢測中心用酶聯免疫法檢測水產苗種中氯霉素殘留量取得了一定的操作經驗，已獲得“CMA”和“CATL”資質，得到山東省市場監督管理局和山東省農業農村廳等監管部門的官方認可。現將試驗情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

MK3微孔板酶標儀、微量移液器、多道微量移液器（賽默飛世爾科技有限公司）；PL202-L電子精密天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；TG16-WS2臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；渦旋混合器（美國Talboys公司）；DC-24水浴氮吹儀（上海安譜試驗科技股份有限公司）；10 D經濟型純水儀（上海摩勒科學儀器有限公司）；DNP-9002BS-III電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；BCD-215KS海爾電冰箱（青島海爾股份有限公司）；-10～50℃、10%～90%RH溫濕度表（北京康威儀表有限責任公司）；JYL-C022九陽料理機（九陽股份有限公司）。

1.2 化學試劑

96孔氯霉素檢測試劑盒（美國柏爾生物技術公司）；去離子水；分析純乙酸乙酯（上海國藥集團化學試劑有限公司）；分析純正己烷（天津科密歐試劑有限公司）。

1.3 樣品前處理

日照市海洋與漁業研究院綜合檢測中心提供給國家北方蝦蟹產業技術體系日照站、山東省現代農業刺參產業技術體系日照綜合試驗站和山東省現代農業魚類產業技術體系日照東港綜合試驗站氯霉素標準儲備溶液，委托其用聚乙烯桶分別培育中國對蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種和牙鲆苗種的陽性樣本作為試驗對象，空白樣品的樣本亦由其提供。開始試驗前，挑出樣品中餌料等雜質，用去離子水清洗、瀝干，用九陽料理機攪碎成糜狀，充分混合均勻，放入冰箱2～6℃冷藏待檢。

1.4 氯霉素的提取

準確稱取糜狀樣品（3.00±0.01)g置于25 mL聚丙烯離心管中，質控樣品中加入標準溶液測定加標回收率，50℃孵育30 min；加入6 mL乙酸乙酯，以最大轉速渦旋振蕩5 min，室溫（22.5±2.5）℃，4 000 r/min離心10 min；移取4 mL乙酸乙酯上清液（相當于2.00 g原始樣品），置于10 mL聚丙烯離心管中，60～70℃水浴氮氣吹干。

1.5 樣品凈化

加入2.00 mL正己烷溶解干燥物，加入1.00 mL 1倍的樣品提取液，最大轉速渦旋振蕩2 min；室溫（22.5±2.5）℃，4 000 r/min離心10 min，去除上層正己烷層，下層溶液供酶標板進行檢測。

1.6 試驗方法

移取標準溶液或樣品上機液100μL，置于對應的酶標板孔中；再按以上順序加入50μL CAPHRP，輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，室溫（22.5±2.5）℃避光孵育30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔及時加入洗滌液250μL，輕輕振蕩混勻1 min，將孔內液體甩干，重復洗板步驟3次，每次間隔10 s，在吸水紙上倒扣、排干（排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干）；每酶標板孔加入100μL的底物（TMB Substrate），輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，室溫（22.5±2.5）℃避光孵育15～20 min；每酶標板孔加入100μL的終止液終止反應，輕輕振蕩混勻1 min，供上機測定。在上機前40～60 min打開酶標儀，使儀器狀態穩定，并將測試波長設定為450 nm。

1.7 方法優化

在動物體內，氯霉素（CAP）不只是以游離形式存在，葡萄糖酸苷結合物（CAPG）是其最主要的代謝物形式。若直接用乙酸乙酯對樣品進行提取，只能提取出游離態氯霉素，方法靈敏度降低。為提高方法靈敏度并防止出現假陰性結果，需要對方法進行優化改進，通過升溫孵育將結合鍵破壞，以提高氯霉素檢出濃度。為驗證優化改進的可行性，該試驗采取直接提取和升溫孵育提取。將各試驗站提供的4種不同基質陽性樣品各稱取2組，每組3管，分別設置直接提取和50℃孵育30 min后提取2種方法條件，以驗證優化改進效果。

2 結果與分析

2.1 不同提取劑對樣品的影響

美國柏爾生物技術公司生產的氯霉素檢測試劑盒，提供了乙酸乙酯和乙腈2種氯霉素提取方法，但考慮到對人體的危害性和環境的污染性來說，乙腈比乙酸乙酯毒性大，再加上馬永飛等比較了3種不同的提取劑（乙腈、乙酸乙酯和水）對CAP提取效果的影響，發現乙酸乙酯作為提取劑時，提取效果優于乙腈和水。因此，該試驗選用乙酸乙酯作為氯霉素提取試劑。

2.2 升溫孵育對檢出濃度的影響

升溫孵育對氯霉素殘留檢出濃度的影響情況見表1。表1結果顯示，50℃孵育30 min后提取，氯霉素殘留的平均檢出濃度明顯得到提高，平均提高率為12.4%～13.8%，由此可見，升溫孵育適用于氯霉素的提取，故該試驗將直接提取優化為升溫孵育提取。

表1 升溫孵育對氯霉素殘留檢出濃度的影響

2.3 線性范圍及檢出限

大型儀器分析法和酶聯免疫法的線性范圍見表2 ，大型儀器分析法和酶聯免疫法的檢出限與定量限見表3。與文獻[10-11]中推薦的液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜法相比，酶聯免疫法檢出限較低、靈敏度較高（表2、表3），可以對樣本中氯霉素殘留濃度進行定量判斷。

表2 大型儀器分析法和酶聯免疫法的線性范圍

表3 大型儀器分析法和酶聯免疫法的檢出限與定量限

2.4 加標回收率與精密度（RSD）

對食品中禁用藥物，回收率應在方法檢測下限、2倍方法檢測下限和10倍方法檢測下限進行加標回收率試驗。選取4種不同基質的氯霉素陰性樣品，分別做樣品添加濃度為0.025，0.050，0.250μg/kg的3個加標水平進行檢測，每個加標水平平行測定6次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）（表4）。與大型儀器分析法的自動進樣方式不同，酶聯免疫分析法是手動進樣。操作可調試移液器采用“吸二打一”的手法，可縮小偶然誤差、增加微量進樣的穩定性、確保精密度并提高加標回收率。

表4 不同基質、不同加標水平的加標回收率和相對標準偏差

2.5 基質效應

由表4可見，酶聯免疫法回收率高、重復性好，蝦、蟹、參、魚各種基質苗種平均回收率測定為71.2%～113.5%，相對標準偏差測定為3.3%～9.2%，符合“70%≤加標回收率≤120%、相對標準偏差（RSD）≤10%”的質量控制規定，且靈敏度高，檢測下限可達0.025μg/kg，在0.05μg/kg的低加標水平下，回收率依然可達70%～120%的質控范圍，能滿足為水產品質量安全執法部門篩選陽性樣品的要求。

3 結論

酶聯免疫法的缺點是影響因素較多，易出現大量假陽性結果，抗體批次不同，測定結果也會出現差異，但靈敏快捷、高精密度且簡便易行是酶聯免疫法在藥物殘留分析方法中的最大優勢。多年來，日照市海洋與漁業研究院綜合檢測中心一直承擔著市級水產苗種質量安全監督抽查和風險監測任務，為市級漁業主管部門的管理工作和執法檢查提供強有力的技術支撐。在實際檢測工作中，不可能也無必要對所有水產苗種采用各種復雜、耗時、昂貴的大型儀器分析方法，建立靈敏度高、特異性強、簡便易行的酶聯免疫分析法，及時為管理部門提供執法依據。