干酪乳桿菌培養上清液對小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究

周穎 張謝 許豐 馬燕燕 吳俊男 邵初曉

急慢性肝損傷的患者常常存在腸道菌群失調，表現為菌群多樣性及雙歧桿菌等益生菌數量明顯減少，而腸球菌、腸桿菌及厭氧梭菌等致病菌的數量顯著増多[1]。有研究顯示，益生菌對肝損傷具有一定的保護作用，其中乳桿菌亞種如鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌對酒精性肝損傷具有保護作用[2]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，常和嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌并稱為“健康三益菌”。研究表明干酪乳桿菌具有降低膽固醇、免疫調節等作用，還能改善乳糖不耐受、緩解過敏[3-4]，但目前還鮮有干酪乳桿菌是否對急性肝損傷具有保護作用的報道。因此，本研究擬探究干酪乳桿菌培養上清液（lactobacillus casei-supernatants,LC-cs）對四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用及相關機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research,ICR）培育的雄性ICR小鼠24只，無特定病原體級，8周齡，體重20～25 g。由溫州醫科大學實驗動物中心提供。飼養在12 h的光/暗循環條件下，維持25℃的飼養環境。

1.1.2 干酪乳桿菌培養 干酪乳桿菌購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。將干酪乳桿菌種子液接種于番茄汁培養基中，40～42℃培養16～20 h后置于2～6℃培養12～16 h。培養液離心，收集上清液并用膜過濾器分離過濾，得到細胞外代謝物，即LC-cs。

1.1.3 主要試劑和儀器 CCl4購自上海麥克林生物科技有限公司；ALT、AST試劑盒購自南京建城生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）及脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL） 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1,HMGB1）、TNF-α 和IL-6酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）抗體購自美國CST公司；三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體購自美國Bioworld Technology公司；B淋巴細胞瘤-2基因（B cell lymphoma 2,Bcl-2）、Bcl-2相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、葡萄糖調節蛋白 78（glucose-regulated protein 78,GRP78）、活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6,ATF6）抗體購自英國Abcam公司；NF-E2相關因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）抗體購自美國Proteintech公司；山羊抗鼠和山羊抗兔IgG-HRP二抗均購自杭州聯科生物公司；Trizol RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量q-PCR試劑盒均購自北京寶日醫生技術有限公司。激光共聚焦顯微鏡（Ti-U型）購自日本Nikon公司；高速低溫離心機（micro21R型）購自美國ThermoFisher公司；凝膠成像系統（chemidoc XRS+型）購自美國Bio-rad公司；熒光定量PCR（Light Cycler 480Ⅱ型）購自瑞士羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備 將24只小鼠用隨機數字表法分為CCl4組、LC-cs+CCl4組和對照組，每組8只。LC-cs+CCl4組小鼠用加有LC-cs的飲用水喂養2周，保證小鼠攝入LC-cs 1 ml/d，另兩組用普通飲用水；2周后LC-cs+CCl4組和CCl4組腹腔注射用玉米油稀釋為0.2%的CCl4 10 ml/kg以誘導急性肝損傷，對照組小鼠用玉米油（10 ml/kg）腹腔注射。所有操作均符合溫州醫科大學動物保護機構及實驗動物倫理學規定。

1.2.2 小鼠急性肝損傷評估 腹腔注射24 h后對小鼠稱重，采用水合氯醛麻醉，經眶靜脈留取外周血，處死小鼠后留取肝臟組織并稱重。計算各組小鼠的肝臟指數（肝臟指數=肝臟質量/小鼠體重）。外周血離心后取血漿，按照試劑盒說明書測定小鼠血漿ALT、AST和HMGB1水平。取小鼠肝臟組織約4 g，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm切片后進行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

1.2.3 小鼠肝臟組織炎癥因子測定 采用ELISA法按照試劑盒說明書測定肝臟組織中IL-6和TNF-α的蛋白表達水平，RT-PCR法測定肝臟組織中IL-6和TNF-α mRNA表達水平。RT-PCR檢測時先用Trizol一步法提取小鼠肝臟組織總RNA，再按試劑盒說明書進行逆轉錄。引物由上海生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-PCR檢測的引物序列

1.2.4 小鼠肝臟組織細胞凋亡檢測 采用TUNEL試驗檢測肝臟組織凋亡細胞，根據TUNEL試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察。采用Western blot法測定凋亡相關蛋白BAX、Bcl-2表達情況。具體步驟如下：二喹啉甲酸法測定肝臟組織總蛋白濃度，蛋白變性后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜上，3%胎牛血漿白蛋白封閉液，室溫孵育1 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃封閉過夜，棄一抗，用緩沖液洗 3遍；加入二抗（1∶10 000），室溫孵育 2 h后，棄二抗，緩沖液洗3遍，化學發光顯色劑顯色，曝光，測定蛋白表達量。

1.2.5 小鼠肝臟組織氧化應激指標測定 根據試劑盒說明書測定肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD及MDA水平。用Western blot法測定肝臟組織Nrf2蛋白表達水平。

1.2.6 小鼠肝臟組織內質網應激相關蛋白測定 用Western blot法測定肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 采用GraphPad 8.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠急性肝損傷評估 小鼠肝臟指數及血漿ALT、AST、HMGB1水平比較見表2。小鼠肝臟組織病理學改變見圖1。

表2 小鼠肝臟指數及血漿ALT、AST、HMGB1水平比較

圖1 小鼠肝臟組織病理學改變（HE染色）

由表2可見，3組間小鼠肝臟指數及血漿ALT、AST、HMGB1水平的差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CCl4組小鼠肝臟指數、血漿ALT、AST和HMGB1水平均高于對照組，LC-cs+CCl4組小鼠上述指標均低于CCl4組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

由圖1可見，CCl4組的肝臟組織出現了脂肪變性、炎細胞浸潤、小葉中心充血及壞死，LC-cs+CCl4組的肝損傷改變輕于CCl4組，而對照組小鼠肝臟組織病理學評估基本正常。

2.2 小鼠肝臟組織炎癥因子測定 見表3。

表3 小鼠肝臟組織炎癥因子測定

由表3可見，3組間小鼠肝臟組織IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平的差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CCl4組IL-6和TNF-α的蛋白及mRNA水平高于對照組，LC-cs+CCl4組IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平低于CCl4組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.3 小鼠肝臟組織細胞凋亡檢測 TUNEL試驗結果見圖2。小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白電泳圖見圖3，小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達水平見表4。

圖2 TUNEL試驗結果

圖3 小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白電泳圖

表4 小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達水平

由圖2可見，與對照組比較，CCl4組存在大量凋亡細胞，而LC-cs+CCl4組的凋亡細胞明顯少于CCl4組。

由圖3及表4可見，3組間小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達水平的差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CCl4組BAX表達高于對照組，Bcl-2表達低于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）；LC-cs+CCl4組BAX表達水平低于CCl4組，Bcl-2表達水平高于CCl4組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.4 小鼠肝臟組織氧化應激檢測 小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平見表5。小鼠肝臟組織Nrf2蛋白電泳圖見圖4。

圖4 小鼠肝臟組織Nrf2蛋白電泳圖

表5 小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平

由表5可見，3組間小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平的差異均有統計學意義（均P＜0.01）。CCl4組GSH-Px、T-AOC和SOD水平低于對照組，MDA水平高于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.01）。LC-cs+CCl4組的GSH-Px、T-AOC和 SOD水平高于CCl4組，MDA水平低于CCl4組，差異有統計學意義（均 P＜0.01）。

由圖4可見，與對照組比較，CCl4組Nrf-2表達水平為 0.19±0.11，少于對照組的 0.35±0.14，LC-cs+CCl4組Nrf-2表達水平為1.06±0.23，高于CCl4組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。3組小鼠Nrf2比較，差異均有統計學意義（F=36.99，P＜0.01）。

2.5 小鼠肝臟組織內質網應激相關蛋白測定 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白電泳圖見圖5，小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平見表6。

圖5 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白電泳圖

表6 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平

由圖5及表6可見，3組間小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平的差異均有統計學意義（均P＜0.05）。CCl4組GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平高于對照組，而LC-cs+CCl4組GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達水平低于CCl4組，差異有統計學意義（均 P＜0.05）。

3 討論

肝臟是人體最重要的解毒器官，大部分藥物和毒物進入人體后都需經肝臟代謝，導致肝損傷發生風險升高。急性肝損傷是臨床上常見的肝損傷類型，主要病因包括藥物、酒精和病毒感染等。其中藥物誘發的急性肝損傷越來越常見，我國一項大規模的多中心回顧性研究發現，中國的藥物性肝損傷年發病率高達23.80/10萬[5]。CCl4是能夠引起肝細胞壞死的毒性化合物，經肝臟細胞色素 P450代謝成三氯甲基自由基，由于CCl4在動物體內可部分重現人類肝臟損傷病程，是常用的動物肝損傷模型的造模劑[6]。近年來，有研究顯示益生菌對急慢性肝病具有一定的治療作用，但因其不穩定性和不良反應限制了其臨床推廣[7]。也有研究證實，益生菌的治療作用可能得益于短鏈脂肪酸、胞外多糖等益生菌產生的生物活性代謝物[8]。因此本研究選用干酪乳桿菌的細胞外代謝物，即培養上清液作為干預藥物，證實其對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用。

HMGB1是一種細胞核內蛋白，也是一種炎癥因子，各種原因所致的肝損傷可導致HMGB1釋放，因此外周血HMGB1檢測可聯合肝功能指標與病理學檢查共同評估肝損傷嚴重程度[9]。本研究結果顯示LC-cs預處理后CCl4誘導的肝損傷減輕，表現為肝臟指數下降，組織病理學改變減輕，ALT、AST及HMGB1下降，說明LC-cs對CCl4誘導的急性肝損傷具有保護作用。

本研究進一步就LC-cs保護CCl4誘導的小鼠急性肝損傷的機制進行了探討。既往研究顯示炎癥反應和細胞凋亡是急性肝損傷發生的主要機制之一[10-11]。IL-6和TNF-α是常用的肝臟炎癥因子，TUNEL試驗可顯示組織中的凋亡細胞數量，聯合促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2的測定可用于評估細胞凋亡情況。結果顯示，LC-cs干預能顯著降低IL-6和TNF-α水平，減少細胞凋亡，說明LC-cs通過抑制肝臟炎癥因子表達和細胞凋亡來保護肝損傷。

CCl4誘導的肝損傷中氧化應激是主要機制之一[12]。因此，可以通過檢測肝臟組織的GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA的水平來評估肝臟氧化損傷[13]。本研究結果表明，LC-cs干預能顯著提高肝臟組織GSH-Px、T-AOC和SOD水平，降低MDA含量。Nrf2抗氧化通路是體內重要的抗氧化系統之一，Nrf2在肝臟中高表達，當ROS攻擊細胞時，受Nrf2調控的抗氧化酶基因表達轉錄激活[14]。該研究結果表明CCl4刺激降低肝臟Nrf2表達，而LC-cs干預可逆轉該變化。以上結果表明LC-cs可通過減少氧化應激保護肝損傷。

有研究指出，抑制內質網應激可減少肝臟中的脂肪酸氧化[15]。因此，可通過檢測內質網應激相關蛋白GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達來評估內質網應激水平[16]。該研究結果顯示，CCl4處理后上述蛋白水平顯著升高，而LC-cs干預能使這些蛋白水平趨于正常，提示LC-cs可通過抑制肝細胞內質網應激來拮抗CCl4誘導的肝損傷。

綜上所述，LC-cs對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用，可能通過抑制炎癥反應、細胞凋亡，減輕氧化應激及內質網應激等機制發揮作用。LC-cs中發揮保護作用的具體代謝物及作用機制有待進一步研究。