精子DNA損傷對胚胎卵裂模式及胚胎發育的影響

朱家紅，高洋，付濤，鄒佳益，魏彪，韓偉，2，黃國寧，2*

(1.重慶市婦幼保健院生殖醫學中心，重慶 400013；2.人類胚胎工程重慶市重點實驗室，重慶 400013)

精液質量是影響輔助生殖治療結局(包括受精率、胚胎質量及臨床結局)的重要因素，這種影響泛稱為“父系效應”[1]。傳統的精液分析包括精子濃度、體積、活力及形態學分析。DNA損傷的精子可正常存活且形態正常，并能使卵母細胞受精，因此常規的精液分析不能準確反應精子DNA的完整性及其對胚胎質量、臨床結局產生的影響。隨著男性不育癥的病因及機制研究逐漸深入，精子DNA完整性作為一個關鍵參數，為不育癥患者的病因診斷提供了新的依據。目前關于IVF/ICSI周期中精子DNA碎片對胚胎發育及臨床結局影響的研究較多，但結論仍存在爭議[2-3]，因此在臨床實踐中并未常規評估精子DNA完整性，其可能原因是精子DNA碎片檢測方法多樣，不同方法得到的精子DNA碎片指數(DFI)的正常參考值范圍不一，且研究的人群臨床條件不一。精子染色質結構分析(SCSA)是量化精子DNA碎片水平、檢查精子DNA損傷的常用方法之一。

隨著時差培養技術的應用，其不僅可對植入前胚胎進行持續觀察且無需取出培養箱，并可連續提供胚胎發育各階段的詳細定量參數及觀察胚胎的卵裂模式。胚胎的早期卵裂在胚胎發育中具有重要作用，異常卵裂會影響囊胚形成率、胚胎染色體倍性及種植潛力[4-5]。目前植入前胚胎卵裂模式是否會受到精子DNA損傷的影響仍然未知。本研究通過時差培養系統觀察記錄胚胎卵裂模式、胚胎發育情況，隨訪胚胎移植后的種植結局，分析精子DNA損傷對胚胎早期卵裂模式、胚胎發育及種植的影響。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2020年1月至2021年6月于重慶市婦幼保健院生殖醫學中心接受不孕不育癥治療的432對不孕不育夫婦的臨床資料，共432個取卵周期(其中224個周期行新鮮卵裂期胚胎移植)。納入標準：(1)女性年齡<35歲；(2)女方卵巢反應正常；(3)夫妻雙方染色體檢查正常；(4)男方進行DFI檢測。排除標準：排除供精、冷凍精液、受卵、解凍卵子及植入前遺傳學診斷(PGT)周期。

將納入患者根據授精方式不同分為IVF組和ICSI組，每組又按照DFI不同分為DFI<15%和DFI≥15%亞組，即：ICSI DFI<15%組(83例)，ICSI DFI≥15%組(105例)；IVF DFI<15%組(153例)，IVF DFI≥15%組(91例)。

二、研究方法

1.精液常規分析及精子DFI檢測：(1)精液常規分析：男方禁欲2～7 d后于本院男科取精室手淫取精，工作人員確認標本完整性、待液化后根據WHO人類精液實驗室檢驗手冊(第5版)進行精子質量分析。(2)精子DFI檢測：采用精子染色質結構分析(SCSA)方法進行精子DFI檢測。通過流式細胞儀，分析精子核DNA的完整性。

2.控制性促排卵和人工授精：根據女方卵巢反應情況采用個性化的控制性卵巢刺激方案，包括促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑方案或GnRH拮抗劑方案。當超聲測量有至少3個卵泡直徑≥18 mm時，給予HCG注射。HCG注射后36 h超聲引導下經陰道取卵。取卵當日收集新鮮精液，密度梯度離心后制備精液樣本，于卵母細胞取出2～4 h后行常規IVF或ICSI授精，IVF授精濃度約為1萬條精子/50 μl微滴。

3.Time-lapse胚胎培養及卵裂模式觀察：進行原核觀察后，將正常受精的卵母細胞轉入時差培養箱培養，通過Embryo Viewer軟件對受精后第3天的胚胎進行形態學評分并記錄胚胎是否為正常卵裂模式。正常卵裂模式定義為在第1次細胞質分裂時卵裂成兩個大小相同的不同卵裂球，第2次卵裂時兩個卵裂球分別卵裂成兩個大小相同的卵裂球[6]。

根據患者的宮腔條件及胚胎情況制定個體化的移植、冷凍或囊胚培養方案，剩余胚胎將繼續培養至受精后第5天或第6天。

4.主要觀察指標及定義：分別統計ICSI或IVF周期中的正常受精率、囊胚形成率、正常卵裂模式胚胎率以及臨床妊娠率和流產率。IVF周期中2PN受精率=D1出現2PN卵子數/IVF加精卵子總數×100%；ICSI周期中2PN受精率=D1出現2PN卵子數/ICSI注射卵子總數×100%；正常卵裂模式胚胎率=正常卵裂模式胚胎數/2PN卵裂胚胎數×100%；囊胚形成率=囊胚形成數/囊胚培養數×100%；臨床流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料比較符合正態分布的采用t檢驗，不符合正態分布的采用秩和檢驗；率的比較采用χ2檢驗；相關分析采用Spearman檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組男性患者精液參數比較

ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間平均DFI、精子總活力和濃度均有顯著性差異(P<0.05)；各組間男方年齡和體質量指數(BMI)無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組男性患者一般資料及精液參數比較(-±s)

二、各組中女性患者基本資料比較

ICSI和IVF周期中，DFI<15%和DFI≥15%亞組間的女方年齡、BMI、促排卵次數、抗苗勒管激素(AMH)、FSH、LH水平及促排卵過程中Gn用量和天數均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組女性患者基本資料比較(-±s)

三、各組患者胚胎發育情況比較

在胚胎發育方面，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間的獲卵數、MⅡ卵數、2PN受精率、D3可用胚胎數、正常卵裂模式胚胎率及優質囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)，僅囊胚形成率在不同DFI亞組間有顯著性差異(P<0.05)(表3)。

表3 各組患者胚胎發育情況比較[(-±s)，%]

四、各組的妊娠結局比較

對224個鮮胚移植周期的妊娠結局進行統計分析發現，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間平均移植胚胎數、平均移植優質胚胎數及正常卵裂模式胚胎數均無顯著性差異(P>0.05)，臨床妊娠率、種植率和流產率亦無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組妊娠結局比較[(-±s)，%]

五、相關性分析

采用Spearman相關性分析探討精子DFI與正常卵裂模式胚胎率及囊胚形成率之間的相關性，結果顯示DFI與正常卵裂模式胚胎率無顯著相關性(P>0.05)，但與囊胚形成率呈顯著負相關(r=-0.562，P=0.029)。

討 論

精子DNA損傷的原因包括：高水平氧化應激及精漿中抗氧化劑應對不足；精子染色質結構組織不良，使精子更容易受到氧化應激介導的損傷；藥物、熱、輻射等[7]。由于精子本身不能修復DNA損傷，其損傷永久存在。臨床工作中常通過分析精子的濃度、活力以及形態來反映精子的質量，有研究表明精子的活力和形態與精子DNA的完整性密切相關，精子DNA損傷會對男性的生育能力產生影響[8]。本研究結果與之前文獻[9]報道的相似，認為DFI可從分子水平上反映男性的生育能力，高DFI與精子濃度和活力下降相關。

2014年Simon等[10]的研究表明精子DNA損傷會對植入前胚胎產生父系影響，精子DNA損傷增加將會從受精開始對胚胎產生不利影響，并持續到胚胎移植后，導致種植率和妊娠率均顯著降低。父系效應對植入前胚胎的影響可在受精后第1個細胞周期檢測到，如產生高比例的異常受精胚胎，且傾向于緩慢卵裂和異常卵裂[11]。Anbari等[12]研究報道在IVF周期中胚胎卵裂模式與精子DFI水平無顯著相關性(P>0.05)。本研究結果亦提示，ICSI周期和IVF周期中DFI≥15%和DFI<15%的兩組患者的正常卵裂模式胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，提示胚胎的卵裂模式不受精子DFI水平高低的影響，或者可能是因為卵母細胞修復了部分精子DNA損傷的結果。目前對于卵母細胞修復精子DNA損傷的機制還不清楚，精子中心體對于有絲分裂紡錘體的影響可能是影響卵裂的潛在原因[13]。

有文獻報道高精子DFI與低囊胚形成率相關[14]，也與胚胎發育停滯相關[15]。本研究結果提示囊胚形成率降低與高水平的精子DNA損傷有關。雖然父系對胚胎發育的影響可能在受精后就存在，但隨著合子基因組激活，父系對受損染色質的影響逐漸突出。但盡管DFI≥15%組的囊胚形成率下降，最終所得的優質囊胚率并無顯著性差異(P>0.05)。人類和動物模型證據均表明，在胚胎發育過程中早期胚胎有能力通過激活母體驅動機制修復精子內的DNA損傷，然而這種能力有限，其可能存在一個閾值，超過這個閾值，將無法修復；且該修復能力與卵母細胞的質量有關[16]。

本研究中，我們優先選擇卵裂模式正常且相對優質的胚胎移植，觀察精子DFI水平對種植率和流產率的影響，結果提示無論是ICSI授精還是常規IVF授精，DFI<15%組與DFI≥15%組間的2PN受精率、臨床妊娠率和流產率均無顯著性差異(P>0.05)，與Green等[17]的報道一致。但也有文獻報道精子DFI水平高低對胚胎質量和臨床妊娠率無明顯影響，與流產率則呈顯著相關(P<0.05)，精子DFI越高，流產率越高[2]。這可能與卵母細胞或胚胎的修復能力不同，以及移植胚胎質量的不同有關，Green等[17]的研究中移植的均是染色體正常的胚胎，本研究中移植的胚胎則經過了卵裂模式的篩選。Zhao等[18]報道高精子DFI的患者IVF周期妊娠率顯著下降，ICSI周期的妊娠率未受影響，認為ICSI授精可以避免精子受到氧化應激的影響，減少精子DNA損傷。但也有學者認為高精子DFI對IVF周期的正常受精率和胚胎質量沒有明顯影響，這可能與IVF授精方式更接近自然受精，按照優勝劣汰原則自動篩除了高DFI的精子有關[19]。2017年和2021年的兩項薈萃分析結果顯示隨著精子DFI升高，IVF或ICSI周期的妊娠率呈下降趨勢，但平衡研究條件后精子DFI水平的高低對IVF/ICSI妊娠結局的影響無明顯差異[20-21]。盡管精子DFI水平高低與男性的精液質量相關，但由于檢測方法、研究人群以及設定閾值的差異，其對輔助生殖治療過程中胚胎質量和妊娠結局的影響尚無統一定論。且本研究納入樣本量較小，研究結論存在一定的局限性，后續需要設計良好的大樣本量隨機對照試驗進一步加以探討。

綜上所述，本研究結果提示精子DFI高低與男性的精子濃度和活力相關；胚胎的早期卵裂模式可能不會受到精子DFI的影響，而囊胚形成率降低與高DFI顯著相關。雖然目前精子DFI高低對輔助生殖妊娠結局的影響尚無定論，但合理進行DFI檢測，可能有助于綜合評估助孕治療效果，為不孕不育夫婦提供適宜的治療建議。