凍融卵裂期優質胚胎過夜培養后形成桑椹胚對臨床妊娠結局的影響

雷鑫，馮曉琴，任文娟

(山西省人民醫院生殖醫學科，太原 030012)

隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術的發展，凍融胚胎移植(FET)技術受到越來越多的關注[1]。FET可以增加促排卵周期的妊娠機會，避免胚胎浪費，同時可以降低卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發生率[2]。影響FET成功的因素很多，其中凍融胚胎的發育潛能尤為重要[3]。新鮮周期卵裂期優質胚胎較非優質胚胎有更好的發育潛能及妊娠結局。卵裂期胚胎預測發育潛能的復雜性以及延長培養到囊胚期表觀遺傳性質的改變，使得人們開始關注移植桑椹胚的優勢。本研究通過對我中心FET周期的回顧性分析，探討凍融卵裂期優質胚胎過夜培養后發育為桑椹胚的情況，并進一步研究移植桑椹胚的價值以及在FET周期中的應用。

資料與方法

一、研究對象

選擇2014年1月到2019年12月在本中心行FET的患者為研究對象。

納入標準：女方年齡≤38歲；內膜準備方案為激素替代周期；移植2枚優質胚胎；胚胎解凍后經過夜培養后移植；經過夜培養后，2枚胚胎卵裂球均未生長或者均生長。

排除標準：移植1枚或者3枚胚胎；復蘇胚胎卵裂球有損傷；內膜準備方案是自然周期或誘導排卵周期；胚胎解凍后當日移植；經過夜培養后只有1枚胚胎卵裂球生長；反復種植失敗的患者；女方存在明顯影響妊娠的因素。

共納入311個周期，根據過夜培養后胚胎卵裂球是否分裂生長分為2組：A組(生長組，n=275)和B組(未生長組，n=36)。根據凍融胚胎過夜培養后是否發育成桑椹胚以及達到桑椹胚的胚胎個數將A組分為A0組(2枚胚胎均未發育為桑椹胚，n=82)、A1組(只有1枚胚胎達到桑椹胚，n=105)和A2組(2枚胚胎均達到桑椹胚，n=88)。

二、研究方法

1.胚胎冷凍和復蘇：胚胎冷凍和復蘇均使用Kitazato Kit(KITAZATO，日本)，按照說明書操作。胚胎冷凍：首先將卵裂期胚胎置于ES液中4 min，平衡結束后將其投入VS液中，吹洗數次，并在30 s內將胚胎滴到冷凍載桿尖端位置，迅速投入液氮并套上套管進行保存。胚胎復蘇：整個操作均在37℃臺面上進行。首先將冷凍載桿從液氮中取出，迅速放于TS液待胚胎脫落(1 min)，將胚胎依次移入DS液(4 min)、WS1液(5 min)和WS2液(2 min)中，最后移入預先在37℃、5% CO2培養箱內平衡好的胚胎培養液中過夜培養。

2.內膜準備：FET周期內膜準備均采用激素替代治療。從月經第3天開始口服戊酸雌二醇片(補佳樂，拜耳，德國)1 mg，bid；7～8 d后B超監測子宮內膜生長情況，并根據內膜情況調整藥物劑量；當內膜厚度≥8 mm時，加用黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚制藥)進行內膜轉化，直至移植日，總共5 d，每天的劑量分別是20 mg、40 mg、40 mg、60 mg和60 mg；移植后繼續黃體支持2周，若血清HCG為陽性，則繼續黃體支持8周。

3.冷凍胚胎選擇：根據取卵后第3天(D3)胚胎形態和碎片多少評價胚胎質量，將由雙原核發育而來的Ⅰ級和Ⅱ級胚胎定義為優質胚胎。Ⅰ級胚胎：≥8細胞，卵裂球大小均勻，無空泡，無多核，碎片≤5%；Ⅱ級胚胎：≥7細胞，卵裂球大小均勻或大致均勻，碎片為5%～10%，有少量小空泡，無多核。

4.妊娠結局的評價：在胚胎移植后第14 天測定血清HCG水平。如血清HCG陽性，3周后復查超聲，見妊娠囊者判定為臨床妊娠。胚胎種植率=妊娠囊總數/移植胚胎總數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期總數/FET周期總數×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；流產率=妊娠28周前流產周期總數/臨床妊娠周期數×100%；早期流產率=妊娠12周內自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=發生活產的周期總數/FET周期總數×100%；早產率=發生早產的周期總數/活產周期總數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

共納入311個復蘇雙胚胎周期，臨床妊娠周期數為177個，臨床妊娠率56.9%。

根據復蘇后過夜培養胚胎卵裂球生長狀況分為A組(生長組，n=275)和B組(未生長組，n=36)。兩組患者間平均年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、基礎FSH水平、原發不孕比例、IVF比例、獲卵數、移植日子宮內膜厚度比較均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[(-±s)，%]

二、凍融胚胎過夜培養后卵裂球生長狀態對臨床結局的影響

過夜培養后，A組(生長組)胚胎種植率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于B組(未生長組)(P<0.05)，而組間流產率和早產率均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結局比較(%)

三、凍融胚胎過夜培養后發育為桑椹胚對臨床結局的影響

根據過夜培養后發育至桑椹胚情況將A組分為A0(無桑椹胚)、A1(1枚桑椹胚)和A2(2枚均桑椹胚)3個亞組。A0組胚胎種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率以及活產率均顯著低于其他2組(P<0.05)，而A1組與A2組間無顯著性差異(P>0.05)；3組間流產率、早期流產率以及早產率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 過夜培養后卵裂球生長組的亞組妊娠結局比較(%)

討 論

近年來，隨著人類輔助生殖技術的不斷發展和完善，冷凍胚胎移植技術已成為輔助生殖技術的重要組成部分。FET不僅降低了胚胎浪費的現象，而且可以預防OHSS，避免高孕酮水平影響子宮內膜容受性、薄型子宮內膜、取卵并發癥等情況，彌補了新鮮周期的不足。

目前對于凍融卵裂期胚胎在解凍后有兩種培養方案：一種是在移植當天進行解凍，培養2 h后進行移植；另一種是在移植前一天解凍，過夜培養后第2天進行移植。研究表明，過夜培養可以進一步觀察到凍融胚胎復蘇之后的發育潛能，過夜培養后繼續生長的胚胎有更高的胚胎種植率和臨床妊娠率[4]。因此我中心常規采取解凍/復蘇后過夜培養，僅對于那些移植前一天是周末的患者，會選擇移植當天解凍。

在FET周期中，很多因素會影響最終的妊娠結局，其中移植胚胎發育潛能是影響FET周期結局的主要因素。有研究表明凍融胚胎復蘇后卵裂球進一步生長可以使胚胎發育與子宮內膜更同步，可以提高臨床妊娠率[5]。延長凍融胚胎體外培養時間的好處是可以幫助實驗室篩選出發育潛能較好的胚胎，還可以使移植胚胎與子宮內膜更趨于同步，選擇此類胚胎進行移植有助于提高臨床妊娠率和種植率，降低流產率。在新鮮周期移植中，優質胚胎通常有更好的發育潛能和臨床妊娠結局[6]。因此優質胚胎冷凍后，經過復蘇并在體外進行一定時間的培養，可以進一步觀察其生長情況以預測其發育潛能。有研究發現優質胚胎復蘇后發育速度不同可能影響FET妊娠結局，無損傷、發育速度快的胚胎可以有更好的妊娠結局[7-8]。

胚胎細胞融合，又稱致密化作用。胚胎發育至細胞融合期，各種細胞間連接方式逐步建立起來，基因組轉錄激活已經啟動，此時可以選擇發育潛力更高的胚胎。卵裂期胚胎預測發育潛能的復雜性以及延長培養到囊胚期表觀遺傳性質的改變，使得人們開始關注到移植桑椹胚的優勢。然而，雖然這個時期是卵裂期發育為囊胚期的必然階段，目前仍只有很少關于FET周期中移植桑椹胚的妊娠結局的報道。

本研究發現卵裂球分裂生長組(A組)的胚胎種植率、臨床妊娠率以及活產率均高于無卵裂球分裂生長組(B組)，差異有統計學意義(P<0.05)。這與劉曉景等[9]的研究結果一致，提示凍融優質胚胎過夜培養后是否繼續生長可以預測胚胎的發育潛能。有研究表明，發育遲緩的胚胎染色體非整倍體率會增加，胚胎發育潛能降低[10]，這可能就是凍融胚胎過夜培養后卵裂球未分裂生長的胚胎臨床妊娠結局差的原因。提前解凍卵裂期胚胎過夜培養后的進一步發育情況與臨床結局密切相關，選擇發育良好的胚胎能有效改善妊娠結局。

本研究隨后進一步分析了移植桑椹胚以及不同數目桑椹胚的臨床妊娠結局。經過分析發現：移植2枚胚胎時，包含桑椹胚的移植組其胚胎種植率、臨床妊娠率以及活產率均較沒有桑椹胚組顯著增加，說明凍融優質胚胎過夜培養后若達到桑椹胚狀態可以預測有更好的妊娠結局；與2枚桑椹胚移植組相比，包含1枚桑椹胚的移植組其妊娠結局無統計學差異，仍有較高的種植率和臨床妊娠率。以上結果提示，移植2枚過夜培養后的胚胎時，至少有1枚能夠發育為桑椹胚即可以得到較好的臨床妊娠結局。說明凍融優質胚胎卵裂球能夠發育為桑椹胚對預測胚胎發育潛能具有重要的參考價值。

多胎妊娠是IVF-ET常見的并發癥，會導致一系列母嬰并發癥顯著增加。降低多胎妊娠的發生，避免IVF-ET不良孕產期結局成為輔助生殖治療中亟待解決的問題[11-12]。有研究顯示IVF-ET中影響多胎妊娠最關鍵的因素就是胚胎移植數目[13]。2018年《關于胚胎移植數目的中國專家共識》[14]指出，在輔助生殖助孕過程中減少移植胚胎數目是降低多胎妊娠的最有效措施。然而全國每個生殖中心情況不一，如何在不影響累積妊娠率的前提下，制定符合本中心的胚胎移植數目的方案，選取發育潛能更高的胚胎進行單胚胎移植，降低多胎妊娠率，成為大家關注的焦點。提高胚胎質量并精準選擇高質量胚胎移植是不降低單胚胎移植臨床妊娠率和活產率的重要方法[15]。本研究中，盡管包含1枚桑椹胚移植組的妊娠結局與2枚均為桑椹胚移植組相比差異無統計學意義，但多胎率呈某種較明顯的下降趨勢。因此，在復蘇2枚凍融優質胚胎過夜培養后形成至少1枚桑椹胚的情況下，可以考慮移植其中1枚桑椹胚或者1枚桑椹胚與1枚非桑椹胚搭配移植，從而降低多胎妊娠風險。而另1枚桑椹胚可以選擇凍回或是繼續培養觀察其進一步發育成囊胚的潛力。

Abuzeid等[16]的一項前瞻性研究顯示，選擇性單囊胚移植可以達到提高臨床妊娠率以及活產率、降低多胎妊娠率的目的。Li等[17]認為，D4桑椹胚移植可達到與D5囊胚移植相似的妊娠結局。與移植桑椹胚相比，移植囊胚存在不利的方面。囊胚培養延長了體外培養時間，并不是所有胚胎都能發育至囊胚階段，最終導致胚胎利用率降低甚至無可移植胚胎而增加周期取消率；而且體外培養體系只是體內環境的模擬，并不能達到與體內完全一致的狀態；同時體外培養時間的延長還增加了表觀遺傳改變的風險[18]。另外，由于融合的發生，使得桑葚胚出現一個相對大的卵周間隙，移植前輔助孵化對卵裂球的干擾風險會降低，使得輔助孵化更加容易和安全[19]。本研究提示過夜培養后的優質胚胎如發育為桑椹胚則妊娠率明顯提高。由于獲得單胎足月活產已成為全球輔助生殖技術的目標和趨勢，因此在移植策略的選擇中，可以通過過夜培養觀察是否能夠成為桑椹胚，進而選擇合適的移植胚胎數目。可以在保證妊娠率的同時降低多胎妊娠風險，盡可能地得到更多健康的嬰兒及更少的孕產期并發癥。

綜上所述，凍融優質胚胎過夜培養后發育為桑椹胚，預示著有更好的臨床妊娠結局，但是移植2枚桑椹胚會導致多胎妊娠率增加。因此對于移植時已有桑椹胚形成的患者，可以考慮行選擇性單胚胎移植，以降低多胎發生率。