外源性全氟丁基磺酸鉀暴露對小鼠植入前胚胎發育的影響

寧安鳳，肖南松，王瑚，管純一，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所遺傳優生中心，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730)

全氟辛烷磺酰基化合物(perfluorooctane sulfonate，PFOS)作為全氟化合物(perfluorocarbons，PFCs)的典型代表，生產及使用時間已超過50 年，常在服飾、電子、機械等領域被用作防水防火等阻燃材料[1-2]。但由于其毒性持久并具有高度生物累積性導致人體已被檢測出全氟化合物的存在，最高約達10-6mol/L[3-4]，并很有可能因此對人類健康造成威脅。因此，2009年PFOS就已被斯德哥爾摩公約成員國列入持久性有機污染物(persistent organic pollutants，POPs)名單中被禁用。

在歐盟高關注度物質(REACH)化學品注冊系統評估方法等認定中，全氟丁基磺酸鉀(PFBSK)雖亦具有含氟表面活性劑的一般性質，但由于氟碳鏈短(圖1)和生物蓄積性不高等特點，被廣泛應用于聚碳酸酯(PC)的阻燃劑。但近期發現，PFBSK具有高度持久可流動性并且可能具有生物毒性，在2020 年初被歐洲化學品管理局(ECHA)添加到REACH候選物質清單中。

圖1 PFOS(左)與PFBSK(右)化學結構式

胚胎作為生物個體起始階段其發育失常可能導致機體未來永久性的結構與功能異常，因此目前在胚胎早期就進行產前診斷。饒群等[5]研究發現，囊胚形態對非整倍體周期的植入前基因檢測具有一定意義。有文獻報道，PFOS急性毒性試驗會引起斑馬魚胚胎發育形態異常、胚胎死亡率加劇及多種生理指標下調[6]。而PFBSK與PFOS具有一定相似性，尤其在高度持久性方面[7]，但PFBSK是否同樣具有生物胚胎毒性尚未得知。

本實驗選取具有代表性的哺乳動物小鼠作為研究對象，通過開展PFBSK急性毒性試驗觀察PFBSK是否對哺乳動物植入前胚胎發育造成一定影響。

資料與方法

一、研究對象

ICR品系健康小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性10～12周齡小鼠8只，雌性6～8周齡小鼠80只。所有小鼠飼養在SPF級動物室，動物室溫度約為25℃、相對濕度約為50%，噪聲保持在60 dB以下。

二、研究方法

1.主要試劑：體外操作液、受精培養基、卵裂培養基、囊胚培養基、血清白蛋白(HSA)均購至美國Sage In-Vitro Fertilization公司；活性氧檢測試劑盒(上海碧云天)；凋亡檢測試劑盒(廣州銳博生物)；注射用血促性素(PMSG)和注射用絨促性素(HCG)購至寧波三生生物；98% PFBSK(Sigma-Aldrich，美國)。

3.體外受精操作準備：實驗前1天將受精培養基預平衡。在受精培養基中添加5%HSA，隨后使用移液器在培養皿中制作約15個50 μl液滴，覆蓋礦物油，于37℃、5%CO2、95%空氣及100%濕度細胞培養箱中預平衡過夜。

6.受精卵卵裂與囊胚形成：將已培養5 h的受精卵換液至提前預平衡2 h以上含5% HSA的卵裂培養基中繼續培養72 h，移入卵裂培養基前應先將受精培養基清洗干凈；待72 h后，將卵裂培養基中的桑椹胚移入平衡2 h以上含5% HSA的囊胚培養基繼續培養24 h至形成囊胚，移入前也將卵裂培養基洗凈。

7.早期胚胎急性暴露PFBSK方式：精子與卵母細胞受精完成后，將約30顆受精卵設為一組，置于含有不同濃度[0 mol/L(對照組)、10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L及10-6mol/L]PFBSK的卵裂培養基中培養；72 h后移入各個相應PFBSK濃度的囊胚培養基中。在植入前胚胎體外培養過程中，統計對照組與各實驗組的1-細胞數(受精卵，0 h)、2-細胞數(24 h)、≥4-細胞數(48 h)、桑椹胚數(72 h)及囊胚數(96 h)，并以1-細胞數為總數，計算其余時期胚胎的發育率。實驗重復5次后，進行統計學差異性分析。

8.活性氧水平檢測：利用活性氧檢測試劑盒內的熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測。DCFH-DA進入細胞后會形成DCF發出熒光信號，繼而用共聚焦顯微鏡檢測DCF熒光信號強度(激發波長488 nm，綠色熒光)，并利用Image J計算平均熒光強度，以此代表活性氧水平。實驗重復3次后，進行統計學差異性分析。

9.凋亡水平檢測：凋亡檢測試劑盒采用TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)方法。經TDT酶催化作用，在DNA的3’-羥基末端催化參入florescein-dUTP發出熒光信號，使用共聚焦顯微鏡檢測熒光信號強度(激發波長560 nm，紅色熒光)，并利用Image J計算平均熒光強度，以此代表凋亡水平。實驗重復3次后，進行統計學差異性分析。

三、統計學分析

利用GraphPad Prism9.0軟件中t檢驗統計方法進行單因素方差分析。數據以百分率(%)或平均熒光強度(AU)進行表示，利用方差分析數據之間的組間差異。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、高劑量的PFBSK急性暴露對小鼠受精卵植入前胚胎發育的影響

本實驗從受精卵培養于PFBSK處理過的培養基中開始統計，記為1-細胞數，并以此為總數，統計各個時期的發育率。結果顯示，與對照組相比，PFBSK 10-4mol/L組、PFBSK 10-5mol/L組和PFBSK 10-6mol/L組的2-細胞率、≥4-細胞率、桑椹胚率及囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)，并且胚胎發育形態良好，未見異常；而PFBSK 10-3mol/L組的囊胚率與對照組相比顯著下降(P<0.05)，且在囊胚時期觀察形態發現，該組有部分胚胎停滯于桑椹胚，延長發育時期也無法使其生長至囊胚(表1，圖2)。

表1 PFBSK藥物處理組和對照組植入前胚胎發育率的比較[n(%)]

圖2 PFBSK藥物處理組和對照組植入前胚胎發育形態觀察(×100)

二、高劑量PFBSK急性暴露對小鼠植入前胚胎活性氧水平的影響

胚胎發育率結果提示，當PFBSK達10-3mol/L時會對胚胎造成損傷。為研究損傷機制，選取PFBSK 10-3mol/L組與對照組發育96 h至囊胚時期的胚胎，進行活性氧水平比較。結果顯示，PFBSK 10-3mol/L組平均熒光強度顯著高于對照組(P<0.05)(圖3)。此結果說明過量的活性氧可能是由于高劑量PFBSK急性暴露引起的氧化還原失衡所導致，而最終造成了囊胚異常發育。

A：共聚焦顯微鏡熒光圖(×400)；B：平均熒光強度統計圖。組間比較，*P<0.05。圖3 10-3 mol/L PFBSK組和對照組活性氧水平的比較

三、高劑量PFBSK急性暴露對小鼠植入前胚胎凋亡水平的影響

為研究是否由活性氧堆積觸發凋亡通路引起早期胚胎損傷，我們進行了TUNEL實驗。結果顯示，培養96 h后，PFBSK 10-3mol/L組囊胚時期胚胎雖出現了發育率下降現象，但與對照組相比，PFBSK 10-3mol/L組的胚胎細胞凋亡平均熒光強度無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A：共聚焦顯微鏡熒光圖(×400)；B：平均熒光強度統計圖。圖4 10-3 mol/L PFBSK組和對照組凋亡水平的比較

討 論

隨著新興技術的蓬勃發展，大量的化學物質被廣泛應用到各個領域，極大滿足了人們日常需求，但由于長期接觸類化合物后發現此類物質可能對人體產生不可逆損傷，因此外源性化學物質毒性研究日益受到重視。此外，在一些研究調查中，研究者憑借胚胎對環境敏感性，常利用胚胎檢測環境中是否存在有害物質，以此對自然與社會環境進行優化[8]。因此，無論從何種角度來說，研究外源化學物質對胚胎造成損傷是十分必要的。

在工業使用及加工制品當中，PFBSK作為添加劑應用于各個領域，如電鍍、紡織、皮革、造紙、消防、選礦等行業。根據用途不同，PFBSK釋放量也有所不同，其中紡織、皮革、消防所占比重最大。國內有學者在2006至2008 年間，選取10座發展迅速城市檢測了自來水中PFBSK含量，其中最高為18 ng/L[9]。而結合其他調查[10-13]，通過估算全國范圍內水體PFBSK含量約為49.6 ng/L。盡管根據經濟合作與發展組織(OECD)采用的檢測方法觀察到PFBSK 的生態毒性危害和風險均低于 PFOS，但目前并沒有研究證明PFBSK不會導致人體急慢性中毒。胚胎毒性在PFCs家族中存在較為普遍，據文獻報道除PFOS外，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)也具有明顯的胚胎毒性，小鼠妊娠期急性暴露PFOA會降低產仔數并使生殖系統發育不良[14]。因此，不難讓人懷疑PFBSK作為替代品是否同樣具有胚胎毒性。

本實驗研究對象選擇受精卵時期胚胎，通過高劑量急性暴露PFBSK建立損傷模型，統計植入前各個時期胚胎發育率與對照組差異以及胚胎細胞內活性氧和凋亡水平進行檢測，來判斷PFBSK是否具有胚胎毒性及以何種途徑體現。實驗結果發現，劑量在10-4mol/L、10-5mol/L和10-6mol/L PFBSK的外源性急性暴露并未引起植入前胚胎發育率下降，但在10-3mol/L PFBSK急性暴露下會影響胚胎細胞的囊胚率(P<0.05)，說明PFBSK存在著潛在的胚胎毒性；之后我們應用DCHF-DA探針進行胚胎細胞內活性氧的檢測，發現10-3mol/L的PFBSK急性暴露96 h后，活性氧的水平顯著高于對照組；既然外源性急性暴露PFBSK會引起新陳代謝異常產生大量活性氧，那么該行為可能會使早期胚胎誘發線粒體損傷。線粒體損傷嚴重可能引起細胞自主凋亡，為檢測損傷是否直接引起早期胚胎走向凋亡途徑，我們又應用florescein-dUTP探針進行檢測凋亡水平。但在凋亡水平檢測中并沒有發現對照組與10-3mol/L PFBSK之間存在顯著性差異。在毒性領域實驗中，有PFCs成員暴露引起活性氧積累的氧化應激損傷案例[15]。活性氧作為第二信使的一種，因在植入前胚胎發育時期參與胞質成熟細胞信號轉導，所以如若發生活性氧動態平衡失調極易誘發線粒體功能障礙引起胚胎損傷，例如出現植入前胚胎發育阻滯及死亡現象[16]。但由PFBSK急性暴露引起的堆積活性氧并未引起胚胎發育阻滯，現象僅為囊胚率異常，并且細胞凋亡水平也并未發現異常，所以PFBSK急性暴露可能并未引起自主有序死亡途徑激活。活性氧異常升高可能導致多種途徑發生改變，例如，高活性氧可能通過妨礙發育時期磷酸化作用和去磷酸化作用錯誤調節細胞周期，或使去乙酰化酶不能正常運轉從而導致對植入前胚胎發育造成一定的負面影響[17-18]。

本文根據統計植入前胚胎發育率和檢測生理指標，發現高劑量PFBSK急性暴露可能通過氧化應激損傷導致早期發育胚胎產生潛在的毒性，但對于揭示PFBSK對哺乳動物植入前胚胎發育影響的目標而言，尚需進一步的深入探討。在進一步開展實驗中應利用更為充分的檢測方法評價微細結構和功能變化來驗證PFBSK的胚胎毒性，并探究通過何種機制導致早期胚胎發育受阻，從而為PFBSK的調查與評估提供理論支持并向安全使用新型材料提供科學依據。