基于自噬探討化療性卵巢功能不全的作用機制

劉鳳霞，李慕軍

(1.廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院廣西生殖醫學研究中心，南寧 530021)

化療性卵巢功能不全是一種醫源性疾病，表現為化療后出現卵泡閉鎖、卵巢儲備持續下降、生育力低下、卵巢功能減退甚至衰竭，最終發展為絕經，目前缺乏有效的治療措施。兒童和育齡期女性是生育力保存的重點人群，該人群好發的惡性腫瘤包括白血病、中樞神經系統腫瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌、生殖系統腫瘤等，化療藥物廣泛應用于上述惡性腫瘤以及其他非惡性疾病(如自身免疫性疾病等)的治療[1]。常用的化療藥物包括烷基化藥物(環磷酰胺、白消安等)、鉑類復合物(順鉑等)、蒽環類(阿霉素等)、紫杉烷類(多西紫杉醇等)、拓撲異構酶抑制劑(依托泊苷)和植物生物堿(長春花堿)等。其中，烷基化藥物的卵巢毒性最大，其次是鉑類、蒽環類[2-3](文中提及的化療藥物特指這三類化療藥)。為了研究確切有效的卵巢保護劑，需要深入了解化療藥物對卵巢的損傷機制。目前具體的分子機制尚不明確，本綜述基于自噬探討化療性卵巢功能不全的作用機制。

自噬是將內源或外源的細胞質物質運送到溶酶體進行降解的過程[4]。經典自噬過程包括雙層膜自噬小體的形成、自噬小體與溶酶體的融合、自噬溶酶體內物質的降解。自噬相關基因(autophagy-related genes，ATG)參與調控自噬的各個環節。自噬屬于細胞程序性死亡的一種表現形式，其生理功能包括適應應激、維持細胞內穩態，參與機體分化和發育，防止基因組損傷，清除有害物質、避免不必要的物質在體內堆積等。在疾病的發生發展過程中，自噬發揮著“雙刃劍”的作用，一方面對應激的適應性反應促進了細胞生存，另一方面過度激活或抑制會介導細胞死亡。

化療藥物對卵巢功能的損傷表現為不同生長階段的卵泡丟失，尤其是原始卵泡的顯著減少。化療后卵巢剩余的原始卵泡數目直接決定了之后的卵巢生殖壽命。保護生育力的重點在于避免或減少化療藥物的對原始卵泡的損傷。目前化療藥物損傷卵巢功能的機制主要包括以下兩種假說：激活卵巢細胞的死亡途徑，原始卵泡的過度激活。

一、化療藥物激活卵巢細胞的死亡途徑

化療藥物對卵巢細胞造成的DNA損傷，或通過增加氧自由基、破壞卵巢微血管網絡對卵巢細胞造成的間接損傷，均會激活細胞死亡途徑。早期的體內外實驗表明，化療后的細胞凋亡增加，因此認為凋亡是化療性卵巢功能不全的主要機制。動物實驗顯示，應用環磷酰胺后，抗凋亡蛋白BCL-2的表達減少，促凋亡蛋白BAX的表達增加，這些效應共同誘導細胞DNA斷裂，當細胞DNA損傷的積累超過了DNA修復的閾值時，卵巢細胞凋亡上調[5-7]。還有研究顯示，環磷酰胺可導致異種移植小鼠的人卵巢皮質內大量卵泡丟失和DNA片段化，而抗凋亡試劑1-磷酸鞘氨醇可以阻止卵泡凋亡，并維持原始卵泡數量[8]。經阿霉素處理的顆粒細胞，可觀察到活性氧和超氧化物的積累，以及線粒體膜電位的降低，阿霉素誘導氧化應激，促進了線粒體介導的凋亡[9]。此外，阿霉素還可以通過TAp63途徑直接誘導原始卵泡的丟失[10]。有文獻報道，順鉑觸發細胞內內質網應激和線粒體活性氧反應，通過激活Caspase通路導致細胞凋亡[11]。這些實驗結果表明一些抗凋亡分子可以減少部分卵泡丟失，但效果并不確切，因此尚不清楚是否啟動了其他細胞死亡途徑。

凋亡是Ⅰ型細胞程序性死亡，自噬是Ⅱ型細胞程序性死亡。兩者都是由多種類型的應激因子激活的，并受多個共享分子的調控。那么自噬是否也參與了化療性卵泡丟失的機制呢？一般而言，自噬抑制凋亡，是細胞的存活途徑；但若體內環境失衡，自噬也可能導致細胞凋亡。在卵泡發育和閉鎖過程中，自噬和凋亡在卵母細胞和顆粒細胞中共存。在缺乏生長因子的情況下，為了維持細胞的生存，自噬是通過信號級聯來誘導的。然而，在極端的應激條件下，過度的自噬可能會剝奪卵泡在卵母細胞發生的最后階段所需的營養生長因子、生存因子和細胞周期蛋白，最終誘導細胞死亡[12]。此外，自噬小體的積累很可能是誘導凋亡細胞程序性死亡的關鍵事件，通過降低BCL-2蛋白的表達，進而激活Caspase來誘導顆粒細胞的凋亡[13]。自噬的調節還可以通過與凋亡蛋白的相互作用發生，自噬核心蛋白BECN1含有一個BH3結合域，BCL-2可與其結合[14]。在正常情況下，BECN1與BCL-2結合并抑制自噬，但在應激作用下，BECN1與BCL-2解離，從而激活自噬。Madden等[15]應用環磷酰胺活性代謝物建立了大鼠卵巢體外實驗模型，檢測了自噬和凋亡的表達情況，發現藥物誘導可導致卵泡丟失，并同時觀測到自噬核心基因BECN1 mRNA和蛋白的表達均上調，而卵泡丟失被認為主要是通過獨立于 Caspase 的途徑(凋亡的經典通路)發生的。凋亡與自噬具有密切的交互作用，自噬有可能與凋亡共同介導了卵泡丟失。在進行化療性卵巢功能不全的研究時，應該注意自噬和凋亡之間的調控關系。

此外，化療藥物造成的細胞損傷、氧化應激、缺血缺氧的應激也可直接影響自噬。自噬的過度激活或抑制最終會導致細胞死亡。化療藥物主要作用于生長代謝旺盛的細胞，卵巢顆粒細胞有絲分裂指數高，是化療藥物的靶細胞之一。顆粒細胞環繞卵母細胞，通過縫隙連接與卵母細胞傳遞信號，與卵母細胞的生長或死亡密切相關。有研究表明，分離大鼠的卵巢顆粒細胞進行培養，應用環磷酰胺的活性代謝物進行干預，經藥物誘導后的顆粒細胞內活性氧自由基的產生，自噬相關蛋白BECN1表達上調，當自噬過度激活時，顆粒細胞內的成分會過度自我降解，最終表現為卵泡丟失增加[16]。另一項研究應用順鉑誘導人源卵巢顆粒細胞(KGN細胞、COV434細胞)，發現4 h內顆粒細胞的內質網應激上調，8～16 h內自噬被激活，24 h出現細胞凋亡；與未處理的顆粒細胞相比，藥物誘導的細胞的自噬、凋亡水平上調[17]。根據結果推測，順鉑的毒性作用誘導了內質網應激，激活了自噬，進而降解了細胞成分，維持細胞的存活。然而，過度激活的自噬最終會導致細胞的凋亡。體內實驗也有類似的結果。Lu等[18]通過腹腔注射順鉑誘導卵巢功能不全的大鼠模型，取卵巢卵泡膜間質細胞進行分析，發現自噬小體增加、自噬活性上調；應用自噬抑制劑處理后，自噬活性被抑制，正常卵泡數量增加、卵泡閉鎖減少。由此推測，自噬的激活誘導了化療性卵巢功能不全的發生，但是否為發病機制的主要環節、是否同時涉及其他途徑，尚未明確。

二、化療藥物誘導原始卵泡的過度激活

相對于休眠的原始卵泡，發育中卵泡和有絲分裂活躍的顆粒細胞更容易受到化療藥物的影響。因此有學者提出，卵泡的丟失歸因于原始卵泡在化療后短期內發生的過度激活和募集[19]。在生理狀態下，卵巢內卵泡發育處于平衡狀態，以維持一定數量的生長卵泡。原始卵泡受到多種信號通路、激活因子和抑制因子的調控，絕大多數原始卵泡處于休眠狀態，只有極少數被激活處于生長狀態。當應用具有性腺毒性的化療藥物時，卵巢內Hippo、PI3K/PTEN/AKT/mTOR、JNK、TGFβ、JAK/STAT、MAPK等信號通路被激活，觸發了原始卵泡過度激活和募集，最終導致卵泡的耗損[20]。在小鼠和培養的人類卵巢組織中[21-23]，與對照組相比，順鉑/環磷酰胺組的原始卵泡數量明顯減少，但沒有觀察到凋亡增加的現象；早期生長卵泡數量增加、凋亡特征的發生率增加。進一步的蛋白分析顯示，經順鉑處理后的小鼠卵巢內PTEN蛋白表達下調，激活了PI3K/AKT/FOXO3通路，使FOXO3a從細胞核轉移至細胞質，激活了休眠的原始卵泡，激活后的原始卵泡更容易發生凋亡，最終導致卵巢儲備損耗。此外，有研究表明，當順鉑、環磷酰胺誘導生長卵泡大量凋亡，原始卵泡激活的抑制因子(如AMH等)的分泌急劇減少[24-25]。為了補充丟失的生長卵泡、維持生長卵泡的數量，原始卵泡過度激活，短期內對化療藥物敏感的生長卵泡增多，最終導致卵泡的耗損。類似的，阿霉素靶向作用于生長卵泡的顆粒細胞和原始卵泡的卵母細胞，通過誘導生長卵泡閉鎖和過度激活原始卵泡來破壞小鼠的卵巢儲備[26]。

根據已有的研究，化療藥物可通過不同的途徑，誘導原始卵泡過度激活和生長卵泡閉鎖，并與卵泡丟失的結局密切相關。而自噬被認為參與了原始卵泡的激活和生長卵泡的閉鎖。化療藥物影響卵巢儲備的信號通路和自噬相關信號通路具有交互性，形成錯綜復雜的調控網絡。兩者共同的信號通路主要包括氧自由基誘導的內質網應激途徑、鈣信號轉導通路、PI3K/AKT/mTOR通路、JNK通路等。其中，mTOR信號通路是自噬調控中最為重要的通路之一，通路中的mTORC1是自噬的負性調控因子，當出現營養剝奪、饑餓、缺氧等應激狀態，mTOR通路被抑制，最終誘導了自噬的發生。通過調節mTOR，激活自噬可以保護卵泡池儲備，延長雌性大鼠的卵巢壽命[27]。在動物模型中，自噬核心基因(ATG7、ATG9、BECN1)敲除或突變，原始卵泡儲備下降、新生小鼠出生后的生殖細胞過度丟失[28-29]。當給予新生小鼠特異性自噬激活劑或出生后饑餓誘導自噬時，原始卵泡的數量增加[30-31]。通過對不同階段卵泡的細胞成分進行分析，發現自噬主要發生在卵巢顆粒細胞中，顆粒細胞自噬可能直接參與了卵泡發育的各個階段的卵泡閉鎖環節[32]。此外，有研究表明，自噬在變形的卵泡和退化的黃體中表現為死亡機制[33]。因此推測自噬在卵巢中卵泡的生長發育具有復雜的調控趨勢：維持原始卵泡池的大小，同時也可以誘導各級卵泡的閉鎖。自噬與卵泡的生存或死亡密切相關。然而，自噬在化療后原始卵泡激活的具體作用是激活還是抑制尚不清楚，還有待闡明。

在進行抗腫瘤以及對非腫瘤性疾病治療時，需要同時關注保護患者的生育力[34]。自噬在化療性卵巢功能不全中的作用及機制目前尚不明確，有待深入研究。過度的自噬激活可誘導卵巢細胞的死亡途徑，而生理情況下的自噬可以保護原始卵泡避免過度激活。自噬的促細胞存活途徑和促細胞死亡途徑有可能相互獨立地進行調控，并在不同類型的卵巢細胞發揮不同的作用。研究化療藥物誘導卵巢功能損害的分子機制具有重要的臨床意義，正確運用自噬促進劑和抑制劑來實現化療后生育力的保存，可能為臨床治療提供新的思路，減少或預防化療藥物介導的卵巢衰竭和不孕，實現腫瘤患者的生育力保存。