miR-98靶向EZH2調控下咽癌細胞轉移及其上皮-間充質轉化的作用機制研究*

阿布利克木·依明 艾力根·阿不都熱依木 唐亮 巴圖 盧旦丹

(新疆維吾爾自治區人民醫院 1.耳鼻喉診療中心；2.病理科，新疆 烏魯木齊 830001)

下咽癌是最常見的頭頸部鱗狀細胞癌之一，是一種相對罕見的異質性惡性腫瘤，預后較差[1-3]。器官-保護化療應用于早期階段的下咽癌患者，手術切除和重建主要針對于下咽癌晚期和復發腫瘤患者[4]。盡管最近手術和化療等治療方式不斷進步，但下咽癌的患者的5年生存率并無明顯改善[5]。之前的研究[6-10]表明，小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一大群短非編碼RNA，在包括下咽癌在內的廣泛的人類腫瘤中起著重要作用。近些年研究發現很多異常表達的miRNA與下咽癌發生有關：如Xu等[11]研究表明miRNA 4451的過表達與下咽癌術后放療患者的生存期較差相關；Kikkawa等[12]發現miRNA-504通過靶向CDK6抑制下咽鱗狀細胞癌的癌細胞增殖；另有研究[13]發現miR98/PTEN/AKT通路通過MTDH抑制下咽癌細胞增殖和惡性進展。研究[14]表明miR-98與肝癌增殖、膠質瘤侵襲和肺癌發展等有關。但是有關miR-98調控下咽癌細胞轉移及其上皮間質轉化的作用機制仍不清楚。因此，本研究主要揭示miR-98調控下咽癌Fadu細胞增殖和惡性轉移的機制，為進一步探討下咽癌的發病和轉移機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 35例下咽癌組織及其28例癌旁正常組織來自于我院2016年10月～2021年1月臨床確診的下咽癌患者。所有患者術前均未接受放、化療處理，均經病理證實，于-80℃保存備用。采集標本及其實驗過程均經過患者和家屬的同意，并獲得了本院倫理委員會的批準。人下咽癌細胞(Fadu細胞)購自中國科學院上海細胞庫，反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，DMEM(Dulbecco′s-modified Eagle′s medium)培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司，E-cadherin(ab212059，1:1000)、N-cadherin(ab76011，1:5000)、p-JAK(ab138005，1:1000)和p-STAT3(ab267373、1:1000)抗體購自Abcam，miR-98模擬物和抑制劑來自GenePharma公司。

1.2 方法

1.2.1 Fadu細胞培養 將凍存的Fadu細胞離心后，重懸細胞并置于提前加入10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養液中，懸浮的細胞在37℃、飽和濕度和5% CO2培養箱環境中沉淀并貼壁生長。

1.2.2 Fadu細胞轉染 將培養皿中處于對數期的Fadu細胞稀釋并鋪于12孔板進行轉染，轉染前替換培養液為不含FBS的培養基，細胞融合在75%左右，細胞分為①inhibitor NC組、miR-98 inhibitor組、mimics NC組、miR-98 mimics組。②mimics NC+EZH2 wt組、miR-98 mimics+EZH2 wt組、mimics NC+EZH2 mut組、miR-98 mimics+EZH2 mut組。③siRNA NC組、EZH2 siRNA組、pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2組、pcDNA-EZH2+AG490組。④mimics NC+pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2+mimics NC組、miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2+miR-98 mimics組。通過Turbofect將實現所需的重組質粒和對照質粒轉染至12孔板中的細胞內，繼續培養箱孵育至48 h，細胞樣品采集后立即實驗分析。

1.2.3 細胞增殖測定 將培養皿中用Turbofect轉染成功且狀態良好的Fadu細胞稀釋后接種在96孔板，細胞在適宜生長條件下孵育48 h，每孔用100 μL PBS清洗細胞，再緩慢將10 μL CCK-8液體加至每孔細胞，3 h后取出培養板分析450 nm處細胞的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測 我們先利用TargetScan預測分析miR-98的作用靶基因，選取EZH2后并通過構建EZH2 wt和EZH2 mut載體進行驗證，取EZH2 wt、EZH2 mut質粒再分別與miR-98mimics、mimics NC共同按照說明書轉染到12孔板中融合度為70%～75%的Fadu細胞，48 h后進一步利用雙熒光素酶報告基因盒檢測熒光素酶活性。

1.2.5 細胞侵襲實驗 取Matrigel 100 μL基質加入Transwell上室并使其干燥，將1 mL胰酶(每孔細胞)加入用Turbofect試劑轉染48 h的Fadu細胞中，消化適合后用新鮮培養基重新細胞并制成細胞懸液，取1×105個細胞懸液加入上室，下室用500 μL 含10%FBS DMEM培養基覆蓋，培養24 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機選取不同視野觀察并計數。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平 細胞總RNA的提取利用Trizol法按照說明書進行，提取的RNA測定濃度和純度，參照說明書完成反轉錄，反轉得到的cDNA稀釋10倍并以其為模板進行RT-qPCR，設置3個重復孔，反應完成后使用2-△△Ct法計算基因的相對的表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot檢測蛋白水平 細胞蛋白樣品中加入裂解液提取總蛋白，檢測蛋白濃度后每個泳道加入定量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，按大小不同分離后的蛋白濕轉到PVDF膜，再置于5%的脫脂奶粉配置的封閉液中過夜孵育，PVDF膜置于一抗稀釋液中[E-cadherin(1:1000)、N-cadherin(1:5000)、p-JAK(1:1000)和p-STAT3(1:1000)]過夜反應，TBST洗PVDF膜5次，加入二抗稀釋液在室溫反應2 h，TBST洗PVDF膜5次，PVDF膜上均勻滴加ECL試劑再進行蛋白曝光。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-98 inhibitor促進Fadu細胞增殖、侵襲和EMT miR-98在下咽癌組織中表達量顯著低于癌旁組織(P<0.01)，見圖1A 。miR-98抑制劑下調miR-98表達使細胞增殖能力顯著上升(P<0.05)，見圖1B。與inhibitor NC組相比，miR-98 inhibitor組Fadu細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，見圖1C、D。miR-98抑制劑下調miR-98表達使N-cadherin/GAPDH比值上升(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值下降(P<0.01)，見圖1E、F。說明miR-98 inhibitor促進了Fadu細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖1 miR-98抑制劑下調miR-98表達后分析Fadu細胞增殖、侵襲和EMT能力Figure 1 Analysis of proliferation，invasion and EMT ability of Fadu cells after down-regulation of miR-98 expression by miR-98 inhibitor注：A.miR-98在癌旁組織和下咽癌組織中的mRNA表達；B.miR-98抑制劑下調miR-98表達后Fadu細胞增殖活力；C.miR-98抑制劑下調miR-98表達后Fadu細胞侵襲情況；D.Fadu細胞侵襲數目；E.miR-98抑制劑下調miR-98表達后Fadu細胞EMT情況；F.下調miR-98后E-cadherin與N-cadherin相對表達。與癌旁組織比較，①P<0.05；與inhibitor NC組比較，②P<0.05

2.2 miR-98與EZH2的靶向及其負調控關系 TargetScan預測miR-98和EZH2之間的結合位點，見圖2A。與mimics NC+EZH2 wt組相比，miR-98 mimics+EZH2 wt組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，與mimics NC+EZH2 mut組相比，miR-98 mimics+EZH2 mut組熒光素酶活性無變化(P>0.05)，見圖2B。miR-98模擬物上調miR-98表達顯著降低EZH2 mRNA水平(P<0.01)；miR-98 抑制劑下調miR-98表達顯著提升EZH2 mRNA水平(P<0.01)，見圖2C。說明miR-98靶向EZH2后進一步負調控EZH2在Fadu細胞中的表達。

圖2 miR-98與EZH2在Fadu細胞中的靶向及負調控關系Figure 2 Targeting and negative regulation of miR-98 and EZH2 in Fadu cells注：A.TargetScan顯示miR-98與EZH2的潛在結合位點；B.分析雙熒光素酶報告基因活性；C.miR-98模擬物或抑制劑轉入Fadu細胞后檢測EZH2表達。與EZH2+mimics組相比，①P<0.05；與inhibtor NC組比較，②P<0.05；與mimics NC組比較，③P<0.05

2.3 EZH2 siRNA抑制Fadu細胞增殖、侵襲和EMT EZH2在下咽癌組織中mRNA表達量顯著高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3A。siRNA技術顯著降低EZH2表達使細胞增殖活力明顯下降(P<0.05)，見圖3B。siRNA技術顯著降低EZH2表達進一步減少了Fadu細胞侵襲數目(P<0.01)，見圖3C、D。siRNA技術顯著降低EZH2表達提高了E-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，降低N-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，見圖3E、F。表明EZH2 siRNA抑抑制了Fadu細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖3 siRNA技術顯著降低EZH2表達抑制Fadu細胞增殖、侵襲和EMTFigure 3 SiRNA technology significantly reduced EZH2 expression and inhibited proliferation，invasion and EMT of Fadu cells注：A.分析EZH2在癌旁組織和下咽癌組織中的mRNA表達；B.EZH2 siRNA轉染后Fadu細胞中EZH2的mRNA水平；C.siRNA技術顯著降低EZH2表達后檢測Fadu細胞活力；D.siRNA技術顯著降低EZH2表達后檢測Fadu細胞侵襲；E.Fadu細胞侵襲數目；F.siRNA技術顯著降低EZH2表達后檢測Fadu細胞EMT；G.EZH2 siRNA轉染后Fadu細胞中E-cadherin、N-cadherin相對表達。與癌旁組織相比，①P<0.05；與siRNA NC組比較，②P<0.05

2.4 miR-98 mimics通過EZH2抑制Fadu細胞增殖、侵襲和EMT 與mimics NC組相比，miR-98 mimics組的miR-98表達量明顯升高(P<0.01)，與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2組的EZH2表達量明顯升高(P<0.01)，見圖4A。與mimics NC+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2+mimics NC組的細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值明顯著上調(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值明顯降低(P<0.01)；miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組的細胞增殖活力明顯降低(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值明顯上升(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值降低(P<0.01)；與miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2+miR-98 mimics組的細胞增殖活力明顯升高(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值上調(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值下降(P<0.01)，見圖4B～F。表明miR-98 mimics通過EZH2抑制了Fadu細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖4 miR-98mimics通過EZH2抑制Fadu細胞增殖、侵襲和EMTFigure 4 miR-98mimics inhibited proliferation，invasion and EMT of Fadu cells by EZH2注：A.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉染Fadu細胞后分析細胞活力；B.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉染Fadu細胞后分析細胞侵襲；C.Fadu細胞侵襲數目；D.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉染Fadu細胞后分析細胞EMT；E.E-cadherin/GAPDH及其N-cadherin/GAPDH比值。與mimics NC+pcDNA-3.1(+)組相比，①P<0.05；與miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，②P<0.05

2.5 pcDNA-EZH2通過JAK/STAT3通路促進Fadu細胞的增殖、侵襲和EMT 過表達EZH2組顯著提高Fadu細胞內p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值(P<0.01)，下調EZH2顯著降低細胞內p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值(P<0.01)。表明過表達EZH2能夠激活Fadu細胞內JAK/STAT3信號通路，見圖5A、B。AG490作用細胞后JAK磷酸化水平明顯低于空白組(P<0.01)，見圖5C。上調EZH2表達促使細胞增殖活力提升(P<0.05)，明顯增加細胞侵襲數目(P<0.01)，顯著降低E-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，提高N-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)；與pcDNA-EZH2組相比，pcDNA-EZH2+AG490降低細胞增殖活力(P<0.05)和細胞侵襲數目(P<0.01)，提升了E-cadherin表達(P<0.01)，并降低了N-cadherin表達(P<0.01)，見圖5D～H。表明pcDNA-EZH2通過JAK/STAT3通路促進Fadu細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖5 pcDNA-EZH2通過JAK/STAT3通路調控Fadu細胞的增殖和EMTFigure 5 pcDNA-EZH2 regulated proliferation and EMT of Fadu cells through the JAK/STAT3 pathway注：A.過表達或下調EZH2在Fadu細胞中的表達后分析JAK/STAT3通路表達；B.p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值；C.AG490作用細胞后檢測JAK磷酸水平；D.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細胞后分析細胞增殖能力；E.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細胞后分析細胞侵襲能力；F.Fadu細胞侵襲數目；G.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細胞后分析細胞EMT能力；H.E-cadherin、N-cadherin與GAPDH的比值。與pCDNA-3.1(+)組相比，①P<0.05；與siRNA NC組相比，②P<0.05；與pcDNA-EZH2組相比，③P<0.05

3 討論

盡管許多下咽癌患者在最終的放化療后進行了手術切除，但由于圍手術期并發癥，其預后往往不令人滿意。因此，研究其他可行的治療策略來預防下咽癌是至關重要的。microRNAs是一類非編碼的、高度保守的單鏈RNA[15-17]，通過作為腫瘤抑制基因或癌基因來解除基因表達調控和改變人類癌癥的轉錄后基因沉默[18-19]。miRNA-98在腫瘤生物學的多個方面發揮重要作用，與腫瘤的發生發展密切相關。例如，Yang等[20]研究發現miR-98通過靶向PAK1抑制非小細胞癌肺癌的細胞增殖和侵襲。Fan等[21]認為過表達miR-98可通過下調IKKe抑制膠質瘤細胞系的細胞侵襲。Siragam等[22]發現miR-98通過靶向激活素受體樣激酶-4和基質金屬蛋白酶-11抑制腫瘤血管生成和侵襲。在本研究中，我們發現miR-98在下咽癌組織和細胞系中表達顯著降低。進一步的實驗表明，下調miR-98可促進下咽癌細胞增殖、侵襲及其EMT進程，提示miR-98在下咽癌進展過程中發揮了重要的生物學作用。

Zeste基因增強子同源物2(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是Polycomb group (PcG)蛋白家族的成員。EZH2基因位于染色體7q35上，包含20個外顯子和19個內含子。EZH2是PRC2的催化亞基，包含一個SET結構域，通過影響組蛋白和DNA甲基化在表觀遺傳水平上修飾轉錄[23-24]。有證據表明EZH2作為致癌基因參與了癌變。例如，Huang等[25]報道EZH2在喉鱗癌中過表達，增強了AMC-HN-8細胞的干細胞樣特性。Ko等[26]研究表明，GSK3b失活可促進EZH2的致癌功能，并增強人類乳腺癌中H3K27的甲基化。Zhu等[27]發現miR-138通過靶向EZH2作為腫瘤抑制因子，增強了順鉑誘導的骨肉瘤細胞的凋亡。本研究通過TargetScan預測發現miR-98直接靶向EZH2且負調控其表達。本研究通過下調EZH2表達進一步檢測細胞增殖和轉移的機制，結果表明，下調EZH2抑制了下咽癌細胞增殖、侵襲及其EMT進程。越來越多的研究表明JAK/STAT3通路參與了癌癥的發生發展過程[28]。本研究結果顯示，過表達EZH2可以挽救miR-98模擬物產生的表型，上調EZH2激活了Fadu細胞內JAK/STAT3通路。而我們在后續研究過程中發現過表達EZH2通過JAK/STAT3通路在Fadu細胞增殖、侵襲和EMT過程中發揮促進作用。

4 結論

本研究表明miR-98在下咽癌細胞中發揮抑癌作用，而EZH2是miR-98的作用靶點。進一步研究表明，miRNA-98靶向EZH2激活JAK/STAT3通路調控下咽癌細胞轉移及其上皮間質轉化。因此，這些研究結果表明miR-98可以作為下咽癌治療的靶點。