腦膠質瘤細胞外泌體對血管新生的影響及其機制

許樂宜 張敏 孔令軍 王靜予 費智敏

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院神經外科，上海 201203；2.上海中醫藥大學，上海 201203)

腦膠質瘤是發病于成人中樞神經系統的原發性實體瘤，占原發性中樞神經系統惡心腫瘤的46.1%，世界衛生組織(WHO)依據其病理特點將之分為4級，分別為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級，惡性程度最高的惡性腫瘤患者的5年生存率極低，且中位生存期僅為12～15個月，預后極差，其主要的治療方法為手術切除及放化療，但是外科手術難以完全切除腫瘤，并且手術后放化療效果不佳，腫瘤復發嚴重[1-2]。因此，深入探討腦膠質瘤的發生發展機制從而尋找有效的治療方法至關重要。抗血管新生是臨床上腫瘤治療的常用策略[3]，但是腦膠質瘤微環境中含有大量的異質性新生血管，臨床上針對血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的藥物，如貝伐單抗等對于其治療效果并不佳[4]。外泌體是一類由大多數活細胞分泌的納米級囊泡，腫瘤細胞可分泌外泌體調控腫瘤微環境[5-6]，而腦膠質瘤細胞外泌體是否能夠作用于VEGF而調控腫瘤血管新生尚無明確研究。因此，本研究探討了腦膠質瘤外泌體對血管新生的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質瘤細胞株U373、U87，人臍靜脈內皮細胞HUVEC，人腦膠質細胞HEB(中科院上海生化細胞所)，Transwell小室、Matergial膠(福麥斯生物技術有限公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)，Bax、Caspase3、Caspase9、VEGF、VEGFR2、p-AKT、AKT、GAPDH一抗、山羊抗兔二抗(沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養 取液氮保存的HEB、U373、U87細胞于37℃水浴鍋中迅速解凍，離心后重懸于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，于37℃，5%CO2培養箱中培養；HUVEC細胞培養于含10%胎牛血清及1%的內皮細胞生長因子的DMEM高糖培養基中；當細胞生長至匯合率達80%時進行傳代。

1.3 外泌體的提取與鑒定 將對數生長期的HEB、U373、U87細胞培養基更換為10%的無外泌體胎牛血清的DMEM培養基，培養48 h后收集細胞培養上清液，使用差速離心法提取細胞培養上清中外泌體，具體步驟：將上清液3000×g，4℃離心15 min去除死細胞；然后將上清液6000×g離心40 min，去除細胞碎片；10000×g離心1 h，取上清；100000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μL PBS重懸外泌體，并放在-80℃保存。使用透射電鏡拍照觀察外泌體的形態結構：將透射電鏡所用的銅網平放到稱量紙上，滴加20 μL外泌體溶液，紅外燈下烘烤10 min；烘干后再滴加2滴磷鎢酸，繼續烘烤10 min，用濾紙吸走多余液體，透射電鏡下觀察外泌體結構并拍照。Western blot鑒定外泌體標志蛋白的表達，具體步驟：取200 μL外泌體加入50 μL的RIPA蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，12000×r，離心15 min后，取上清，即為外泌體總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取外泌體蛋白裂解液進行SDS-PAGE凝膠電泳，經轉膜，封閉后CD9、CD63、TSG101一抗孵育過夜，然后二抗孵育，洗膜后，曝光成像。

1.4 細胞遷移實驗 用不含胎牛血清及血管內皮生長因子的DMEM培養基重懸HUVEC細胞，調整HUVEC細胞密度至5×104個/mL，并取200 μL上述HUVEC細胞接種至Transwell小室中，每個小室加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個復孔，小室放置于含有600 μL完全培養基的24孔板，使其底部完全浸入培養基中，并將24孔板置于37℃，5%CO2培養箱培養24 h，取出小室用PBS清洗3次，小室倒扣，底部用甲醇固定30min，晾干后用結晶紫對小室底部染色10 min，清洗并晾干后，在顯微鏡下觀察拍照。

1.5 細胞增殖 取對數生長期的HUVEC細胞，調整細胞密度至3×104個/mL，于96孔板中每孔加入100 μL上述細胞稀釋液，并且設置24、48、72 h時間梯度，按相同的方法平行接種3塊相同的96孔板；96孔板細胞完全貼壁后，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，然后將3塊96孔板放置在培養箱中培養，分別于24、48、72 h后取出對應的96孔板，避光向每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，繼續在培養箱中培養2 h，然后使用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度，以空白組吸光度為背景值。

1.6 小管形成實驗 4℃條件下融化Matrigel膠，96孔板中每孔加入50 μL Matrigel膠，輕輕搖晃96孔板，使Matrigel膠均勻覆蓋于96孔板底部，37℃培養箱中放置30 min，使Matrigel膠充分凝固。取對數生長期的HUVEC細胞，調整細胞密度至3×105個/mL，于96孔板中每孔加入100 μL細胞稀釋液，然后每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個復孔，于37℃，5%CO2培養箱中培養6 h，然后在顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計算小管形成。

1.7 細胞凋亡 取3×105個對數生長期的HUVEC細胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個復孔，共孵育48 h后進行細胞凋亡檢測。根據細胞凋亡檢測試劑盒，每孔取5×105個HUVEC細胞于離心管中，用500 μL的Binding Buffer重懸細胞成單細胞懸液，而后添加5 μL的Annexin V-FLTC和5 μL的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設置Annexin V-FLTC和PI單陽性管用于調熒光補償，空白管用于調電壓。使用流式細胞儀檢測上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數。

1.8 Western blot檢測蛋白水平 取3×105個對數生長期的HUVEC細胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個復孔，共孵育48 h后，每孔細胞加入120 μL的RIPA蛋白裂解液和1.2 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后12000×r，4℃離心10 min，取上清，即為細胞總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以1：1000比例稀釋后的VEGF、GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結果

2.1 外泌體鑒定結果 透射電鏡觀察外泌體結構顯示，外泌體具有雙層膜結構，形態呈“杯托”狀，粒徑在50～100 nm，符合外泌體的形態結構，見圖1；Western blot檢測結果顯示，提取的外泌體表達標志蛋白CD63、CD9、Alix，見圖2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態結構Figure 1 Observation of the morphology and structure of exosomes by transmission electron microscope

2.2 腦膠質瘤外泌體促進HUVEC遷移能力 細胞遷移檢測結果顯示，HEB-exo組HUVEC細胞遷移數目與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)；U373-exo和U87-exo組HUVEC細胞遷移數目顯著高于PBS組(P<0.05)，見圖3。說明腦膠質瘤外泌體能夠顯著促進HUVEC細胞遷移能力。

2.3 腦膠質瘤外泌體促進HUVEC細胞增殖能力 CCK-8法檢測細胞增殖能力結果顯示，相比于PBS組，HEB-exo組HUVEC細胞增殖能力無顯著變化(P>0.05)；而U373-exo和U87-exo組HUVEC細胞24、48、72 h增殖能力顯著高于PBS組(均P<0.05)，見圖4。這提示腦膠質瘤外泌體能夠顯著促進HUVEC細胞增殖能力，從而促進血管新生。

圖4 CCK-8法檢測腦膠質瘤外泌體對HUVEC增殖能力的影響Figure 4 CCK-8 method to detect the effect of glioma exosomes on the proliferation of HUVEC注：與PBS組相比，①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

2.4 腦膠質瘤外泌體促進HUVEC細胞小管形成 小管形成實驗結果顯示，HEB-exo組HUVEC小管形成與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而U373和U87細胞所分泌的外泌體能夠顯著促進HUVEC細胞體外小管形成(P<0.001)，見圖5。這說明腦膠質瘤外泌體能夠顯著促進體外小管形成。

圖5 小管形成實驗檢測腦膠質瘤外泌體對小管形成的影響Figure 5 Tubule formation experiment to detect the effect of glioma exosomes on tubule formation注：與PBS組相比，①P<0.001

2.5 腦膠質瘤外泌體抑制HUVEC細胞凋亡 流式細胞術檢測結果顯示，HEB-exo組HUVEC細胞凋亡率與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)；U373-exo和U87-exo組HUVEC細胞凋亡率均顯著低于PBS組(均P<0.01)，見圖6。Western blot檢測結果顯示，U373-exo和U87-exo組HUVEC細胞促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表達水平均顯著低于PBS組(P<0.001)，見圖7。說明腦膠質瘤外泌體能夠顯著抑制抑制促凋亡蛋白的表達而抑制HUVEC細胞凋亡。

圖6 流式細胞術檢測腦膠質瘤外泌體對HUVEC凋亡的影響Figure 6 Flow cytometry to detect the effect of glioma exosomes on HUVEC apoptosis注：與PBS組相比，①P<0.01，②P<0.001

圖7 Western blot檢測腦膠質瘤外泌體對凋亡蛋白表達的影響Figure 7 Western blot to detect the effect of brain glioma exosomes on the expression of apoptotic proteins注：與PBS組相比，①P<0.001

2.6 腦膠質瘤外泌體對VEGF信號通路的影響 Western blot檢測結果顯示，相比于PBS組，HEB-exo組HUVEC細胞VEGF、VEGFR2表達水平及AKT磷酸化水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)；而U373-exo和U87-exo組HUVEC細胞VEGF、VEGFR2表達水平顯著高于PBS組(P<0.001)，AKT磷酸化水平亦顯著高于PBS組(P<0.001)，見圖8。說明腦膠質瘤外泌體能夠促進VEGF、VEGFR2的表達進而激活促血管生成的AKT信號通路。

圖8 Western blot檢測腦膠質瘤外泌體對VEGF信號通路的影響Figure 8 Western blot to detect the effect of glioma exosomes on the VEGF signaling pathway注：與PBS組相比，①P<0.001

3 討論

腦膠質瘤是一般來自于原始胚胎神經細胞或者為其他神經膠質細胞在顱內的原發腫瘤，臨床上腦膠質瘤的主要治療手段有手術治療及放、化療等[7-8]，但由于腦膠質瘤血管密集，血運豐富，腫瘤細胞的浸潤性極高，不能準確區分腫瘤組織的邊界，為外科手術的治療帶來了極大的挑戰，所以探究腦膠質瘤血管新生的機制，對于提高腦膠質瘤的治療效果至關重要[9-10]。腫瘤微環境中的血管新生不僅可以為腫瘤的生長提供給氧氣和營養物質，還參與腫瘤細胞的遠端轉移以及腫瘤的復發[11]。血管新生在正常生理條件下受到嚴格的調控，只有在病理條件或者特殊的情況下才能夠被激活，并且血管過度的生成以及缺陷都會導致疾病的發生、發展。正常生理條件下的大部分血管呈現發育成熟靜止狀態，但是血管內皮細胞仍具有對生理刺激產生應答反應而快速增殖和遷移的能力，在接受外界信號刺激后，血管內皮細胞啟動增殖遷移的應答反應，開始血管新生的生理過程[12-14]。外泌體是一種由細胞分泌的粒徑在30～100 nm的納米級囊泡，可包裹RNA、蛋白質、脂質等生物活性物質，能夠與靶細胞受體結合或水平傳遞生物活性物質而發揮生物學功能，包括血管新生、免疫逃逸、腫瘤耐藥等[15-18]。

已有研究[19-21]表明，腫瘤外泌體具有調控血管新生的功能，例如卵巢癌外泌體miR-205能夠誘導血管新生而促進腫瘤的轉移，胃癌外泌體miR-130a可靶向血管內皮細胞C-MYB而誘導血管新生，宮頸鱗狀細胞癌外泌體miR-221-3p可靶向THBS2而誘導血管新生。本研究腦膠質細胞U373和U87細胞所分泌的外泌體相比于正常腦膠質細胞外泌體能夠顯著促進血管內皮細胞的增殖、遷移以及體外小管形成能力、抑制血管內皮細胞的凋亡能力，并且下調促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表達水平。說明腦膠質瘤細胞外泌體能夠促進血管內皮細胞血管形成的能力。

血管新生受多種細胞因子的調控，如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)、VEGF、血管緊張素Ⅰ/Ⅱ(Angiotensin，AngⅠ/Ⅱ)等[22-24]。其中，VEGF是屬于血小板源性生長因子家族超家族之一，是促血管活性因子中活性最強、特異性最高的血管生成因子，VEGF與其受體特異性結合后能夠激活酪氨酸激酶信號通路，促進血管內皮細胞的生長和增殖，誘導血管新生，并且增加血管的通透性，促進腫瘤的轉移[25]。腦膠質細胞U373和U87細胞外泌體可促進促血管生成因子VEGF及其受體VEGFR2的表達，促血管新生的PI3K/AKT信號通路中AKT的磷酸化水平顯著增加，PI3K/AKT信號通路被激活。PI3K/AKT信號通路是調控血管新生的重要通路，激活PI3K/AKT信號通路可誘導膀胱癌、皮膚癌、非小細胞肺癌等腫瘤的血管新生[26-28]。本研究發現腦膠質瘤外泌體可調控VEGF表達和PI3K/AKT信號通路而促進血管新生。

4 結論

腦膠質瘤細胞U373和U87外泌體能夠促進體外血管新生，其機制為上調VEGF的表達，激活PI3K/AKT信號通路。