誘導多能干細胞來源的心肌細胞對心肌梗死大鼠的心臟修復作用*

張麗莎 熊挺淋 應夢慧 楊燕 張曉剛

(1.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院，四川 南充 637000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610000；3.四川馳鼎盛通生物科技有限公司，四川 成都 610041；4.重慶醫科大學附屬第一醫院心內科，重慶 400016)

心肌梗死是一種全球性的高發病率和死亡率的疾病[1]，心肌梗死期間心肌細胞的永久丟失有助于進行性病理性的左心室重構，最終導致心力衰竭。利用胚胎干細胞或誘導多能干細胞及其心臟衍生物的細胞療法已被提出作為改善心肌梗死后心功能的有效治療方法。胚胎干細胞和誘導多能干細胞是一種多潛能性干細胞，能夠產生足夠數量的功能心肌細胞，以實現“真正的”心臟再生。與胚胎干細胞不同，誘導多能干細胞是由個體自身的體細胞產生的，因此，誘導多能干細胞分離具有較少的倫理問題，移植后不存在免疫抑制，且誘導多能干細胞還可以克服胚胎干細胞在心臟再生方面的一些局限性。誘導多能干細胞在體內和體外都可以分化為有功能的心肌細胞[2-3]。一些研究[4-6]報道了使用這些誘導多能干細胞來源的心肌細胞在動物心肌梗死模型中移植后心臟再生的功能益處，移植后分化心肌細胞能夠與宿主心肌整合，改善左室功能。然而，誘導多能干細胞分化研究仍處于初級階段，這些細胞改善心臟功能的機制尚不清楚。本文研究誘導多能干細胞分化的心肌細胞對大鼠心肌梗死模型心肌修復的效果，希望闡明其改善心功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 SPF級SD大鼠(不分雌雄)由重慶醫科大學實驗動物中心提供。綠色熒光蛋白(GFP)轉染的小鼠誘導多能干細胞購自中國科學院動物研究所北京干細胞庫。本實驗遵循南充市中心醫院倫理委員會制定的相關規定(倫理審批號:2020年審(148)號)。

1.2 實驗試劑與儀器 DMEM高糖培養基購自Gibco公司，β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清、胰蛋白酶和水合氯醛均購自Hyclone公司，DAPI、牛血清白蛋白、多聚甲醛、Masson三色染色試劑盒均購自Sigma公司，多克隆抗血管假性血友病因子抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、單克隆cTnT抗體及Tritc標記的IgG熒光二抗均購自Santa cruz公司，絲裂霉素C和白血病抑制因子(LIF)購自上海欣百諾公司，免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司，Gold view和Triton X-100購自Genview公司，簡易呼吸機由重慶醫科大學神經病學重點實驗室提供，BL-420多導電生理儀及生物機能實驗系統為成都泰盟科技有限公司生產，超聲心動圖由飛利浦公司提供(CX50)，PowerLab系統由AD Instruments Inc.公司提供，Millar微型壓力導管購自上海玉研科學儀器有限公司，RNAiso Plus逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，S1000TmThermal cycler逆轉錄系統由BIO-RAD公司提供。

1.3 誘導多能干細胞培養 誘導多能干細胞復蘇后接種在提前經絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞上[7]，培養基為DMEM高糖，包含10% FBS、1000 IU/mL LIF、0.1 mmoL/Lβ-巰基乙醇、0.1 mmoL/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，1～2 d換培養基一次；用0.05%胰酶消化傳代，細胞重懸液接種在新的不含小鼠胚胎成纖維細胞飼養層細胞的培養板里，30 min后吸取上清液，并接種到新的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，傳代后的部分細胞保存于液氮中備用。細胞置于37℃、5%CO2培養。

1.4 誘導多能干細胞分化為心肌細胞 取對數生長期的誘導多能干細胞，0.05%胰酶消化并分別制成單細胞懸液，心肌細胞的分化方法參照文獻[1]進行，將搏動的擬胚體制成單細胞懸液，使用差異貼壁法分離心肌細胞，分化心肌細胞置于37℃、5%CO2培養。

1.5 大鼠心肌梗死模型建立和細胞移植 水合氯醛腹腔麻醉成年SD大鼠，氣管插管后通過簡易呼吸機輔助通氣。胸骨左緣剪斷肋骨，進入胸腔，鈍性分離心包并剪開，體式鏡下用結扎線結扎左前降支(LAD)10 min，BL-420多導電生理儀及生物機能實驗系統記錄心電圖。建模成功的心肌梗死SD大鼠隨機分為心肌梗死組和細胞移植兩組，對照組行開胸手術，不結扎冠狀動脈，每組10只。心肌梗死組和細胞移植組分別在心肌梗死邊界附近的3個點注射30 μL的生理鹽水和分化心肌細胞。細胞移植成功后，逐層縫合胸腔及皮膚，待小鼠恢復自主呼吸后，扯去簡易呼吸機，術后給予實驗大鼠肌肉注射青霉素以預防感染。

1.6 超聲心電圖評價心功能 在實驗前及細胞移植后第7、14和28天使用飛利浦CX50超聲儀進行超聲心動圖檢查評估左室功能。標準的M型超聲測量LVEDD、LVESD、LVPW和IVS，并用Simpson法計算LVEF。所有心臟超聲檢查由同一名檢查者完成。

1.7 心臟有創血流動力學評估 有創血流動力學檢查前按照之前的方法對大鼠進行腹腔麻醉和機械通氣，將1.4F的Millar微型壓力導管經股動脈送入左室，并連接壓力傳感器，使用PowerLab系統記錄血流動力學參數，包括±dP/dt、LVEDP。

1.8 RT-PCR檢測各組MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA的表達水平 4周后取出大鼠心臟，使用Trizol提取組織的總RNA，RNAiso Plus逆轉錄試劑盒以及S1000TmThermal cycler逆轉錄系統用來合成CDNA。PCR過程使用25 μL擴增體系，條件：94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s，循環30次。內參(β-actin)及目的基因的引物序列和退火溫度見表1。PCR產物用2%瓊脂糖做凝膠電泳分離條帶，然后用Gold view顯色，結果采用quantity one凝膠電泳儀進行圖像分析和數據處理。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.9 梗死面積的檢測 采用Masson三色染色試劑盒染色分析梗死面積的大小，正常心肌組織顯示為紅色，壞死心肌組織顯示為藍色。28天時取出大鼠心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，然后將石蠟塊切成5 μm切片，石蠟切片脫蠟水化步驟：二甲苯30 min、無水乙醇20 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min，PBS沖洗，Masson試劑盒內鐵蘇木素染色5 min，PBS沖洗，酸性乙醇分化10 s，PBS沖洗后用Masson返藍液返藍3 min，PBS沖洗，Masson麗春紅品紅染色10 min，PBS沖洗，Masson磷鉬酸作用5 min，再用Masson苯胺藍復染5 min，1%冰醋酸作用1 min，再次脫水并封片，最后顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.10 免疫組化 采用SP法中杉金橋公司免疫組化試劑盒進行染色操作。28天時取出大鼠心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，然后切片，石蠟切片脫蠟水化步驟：二甲苯30 min、無水乙醇20 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min，PBS沖洗，3%H2O2中孵育10 min，PBS沖洗，0.01 M枸櫞酸緩沖液中95℃煮沸15 min，冷卻后PBS沖洗，血清液封閉20 min后甩去封閉液，加入兔多克隆抗血管假性血友病因子抗體(1:100)，室溫下作用1 h，PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:100)，室溫下作用1 h，PBS沖洗，加入鏈霉親和素過氧化物酶，室溫下作用30 min，PBS沖洗，DAB顯色5 min，PBS沖洗10 min，蘇木精復染2 min，酸性乙醇分化10 s，PBS沖洗，再次脫水并封片，最后顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.11 細胞免疫熒光 培養在載玻片上的細胞收獲時用PBS洗滌3次，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定30 min，0.1% Triton X-100穿孔10 min，PBS洗3次，然后加入1%的牛血清白蛋白封閉30 min后，甩掉封閉液，用PBS稀釋的單克隆一抗(1:100)，37℃條件下作用2 h，PBS洗3次，再用PBS稀釋的Tritc標記的IgG熒光二抗(1:100)，37℃條件下作用2 h，PBS洗3次，最后用DAPI染細胞核，抗淬滅劑封片以及用熒光顯微鏡照相。

2 結果

2.1 分化心肌細胞特征及鑒定 體外自然分化情況下，誘導多能干細胞形成搏動的擬胚體，搏動的頻率20～40次/min，分離培養分化心肌細胞，呈現出多邊形、不規則形等普通心肌細胞形態，見圖1A。細胞免疫熒光鑒定提示分化心肌細胞中心肌特異性cTnT表達陽性(紅色)，細胞核用DAPI染色(藍色)，見圖1B。

圖1 分化心肌細胞鑒定(200×)Figure 1 Identification of differentiated cardiomyocytes注：A.分化心肌細胞形態；B.分化心肌細胞中cTnT表達陽性(紅色)

2.2 心肌梗死建模成功判定 前降支結扎后，心肌梗死模型成功的標志為結扎處遠端心肌組織變蒼白，體表心電圖提示ST段抬高大于0.05 mV，見圖2。心肌梗死組和細胞移植組大鼠死亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)，最終每組10只大鼠完成實驗。

圖2 心肌梗死模型心電圖Figure 2 ECG of myocardial infarction model注：A.正常心電圖；B.心肌梗死心電圖

2.3 3組細胞移植后心功能比較 在細胞移植后第7、14和28天時通過心臟彩超和有創血流動力檢查測量各組的心臟功能。第28天時，細胞移植組的LVEF較心肌梗死組明顯升高，LVESD和LVEDD顯著小于心肌梗死組，LVEDP明顯低于心肌梗死組，±dP/dt較心肌梗死組明顯改善，差異均有統計學意義(均P<0.05)。在第7和14天時，細胞移植組和心肌梗死組之間的LVEF、LVESD、LVEDD、LVEDP和±dP/dt差異均無統計學意義(均P>0.05)。3組LVPW和IVS比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3和表2。

圖3 LVEF比較Figure 3 Comparison of LVEF

表2 28天時各組心功能比較Table 2 Comparison of cardiac function of each group at 28 days

2.4 3組MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA水平比較 RT-PCR結果顯示，與對照組相比，心肌梗死組大鼠的MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA的轉錄水平顯著升高(P<0.05)，而細胞移植組大鼠的以上衰老基因的mRNA轉錄水平無明顯改變(P>0.05)。見圖4。

圖4 RT-PCR評估衰老指標Figure 4 Assessment of aging indicators by RT-PCR注：與對照組比較，①P<0.05，②P>0.05

2.5 3組梗死面積的染色結果比較 第28天時，細胞移植組的梗死面積(2.29±0.38)mm2明顯小于心肌梗死組(1.36±0.21)mm2，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 梗死面積比較(400×)Figure 5 Comparison of infarct size注：A.對照組；B.細胞移植組；C.心肌梗死組

2.6 3組梗死邊緣區毛細血管密度結果 28天時，抗血管假性血友病因子免疫組化染色結果顯示，毛細血管顯示為深棕色。細胞移植組梗死邊緣區的毛細血管密度(142.70±21.24)/mm2明顯高于心肌梗死組(66.52±11.85)/mm2，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 免疫組化檢測毛細血管密度(400×)Figure 6 Detection of capillary density by Immunohistochemical注：A.對照組；B.細胞移植組；C.心肌梗死組

3 討論

目前主要有兩種類型的干細胞具有心臟再生的潛力，一種是成體干細胞，另一種是胚胎干細胞和誘導多能干細胞的多潛能干細胞，但是這兩種干細胞移植到宿主心臟后都存在畸胎瘤形成和異位分化的風險[8-10]。為了解決這個問題，分化細胞，如干細胞分化來源的心肌細胞，是干細胞移植治療的首選。最近的基礎研究和臨床研究[11-14]表明，人類胚胎干細胞和誘導多能干細胞衍生的心肌細胞對左室重構具有重大治療意義。此外，誘導多能干細胞分化的心肌細胞是由自體體細胞逆分化為干細胞，而后再產生的自體細胞，因此與胚胎干細胞等相比，在移植治療上解決了倫理和免疫排斥問題。然而到目前為止，誘導多能干細胞分化的心肌細胞改善心臟功能的機制尚不清楚。在本研究中，我們發現分化心肌細胞移植后通過減小衰老指標的表達以及增加心肌梗死區域毛細血管密度等可以改善心肌梗死后大鼠心功能。這種作用與血管生成有關，并抑制了局部缺血心肌組織中天然心肌細胞的凋亡，表明心功能改善的機制是由旁分泌作用介導的，對基于誘導多能干細胞的分化心肌細胞移植療法具有重要的臨床意義[15-16]。

本研究將分化心肌細胞在心肌梗死后直接注入心肌組織中，細胞移植4周后，細胞移植組代表左室心功能的LVEF、LVESD、LVEDD、LVEDP和±dP/dt指標較心肌梗死組均得到明顯改善，梗死面積明顯縮小，與之前的報道結果[17-18]相似。分化心肌細胞體外搏動頻率僅為20～40次/min，因此移植細胞不太可能直接促進心臟功能的改善。細胞移植4周后，梗死心臟組織周圍的毛細血管密度明顯增加，可間接證明移植細胞通過旁分泌作用促進血管生成并維持周圍天然心肌細胞的存活率，最終促進心功能的改善。此外，在整個實驗期間我們無在心臟任何區域觀察到畸胎瘤。

分化心肌細胞移植治療改善心臟功能的具體機制尚不清楚，最初的希望是這些移植細胞可以直接促進心臟功能的恢復。最近的研究[15，19]表明，改善心臟功能的作用大多是通過間接作用，包括旁分泌、調節細胞外基質和細胞凋亡，這與本研究的結果非常相似。分化細胞移植后的低存活率也是需要進一步解決的問題[20]。最近一項利用人誘導多能干細胞的分化心肌細胞在豬急性心肌梗死模型的移植治療研究[21]中表明，在細胞移植后8周，熒光原位雜交僅檢測到少量分化心肌細胞，提示移植細胞的長期生存率較低。這種分化心肌細胞的低存活率可能是移植后同種異體免疫排斥的結果。作為直接細胞替代的替代方法，來源于誘導多能干細胞的分化心肌細胞釋放的外泌體代表了一種新型的基于誘導多能干細胞的心肌再生治療[22]。在直接移植分化心肌細胞缺乏足夠細胞存活情況下，間充質干細胞衍生的外泌體在移植后可以促進更長的移植體生存期并增強移植細胞的治療效果[23]。因此誘導多能干細胞的分化心肌細胞分泌的外泌體在心臟再生中的有益作用是未來值得深入研究的方向。

盡管誘導多能干細胞在再生醫學和細胞治療領域有著巨大的潛力，但在其臨床應用之前仍有幾個主要為問題需要解決。首先，使用病毒載體產生的誘導多能干細胞可能導致基因突變或者惡性轉化。目前已有研究表明不需要任何基因修飾就能重編程誘導多能干細胞的方法，并獲得高純度的分化心肌細胞，這些方法包括小分子或者無病毒方法。其次，安全性評估，包括移植后心律失常和腫瘤等的發生情況是細胞治療的重要研究方向。目前的研究主要集中在心臟分化上，而對分化心肌細胞與宿主心肌細胞表型是否一致，以及分化心肌細胞成熟度方面研究甚少。分化心肌細胞的不成熟電表型可能導致心律失常，在以往的胚胎干細胞分化心肌細胞中已報道有心律失常的情況出現[11，24]。與成熟的心肌細胞相比，誘導多能干細胞分化的心肌細胞也表現出不成熟的電生理特點[25-26]，然而在受損的心臟組織中移植入誘導多能干細胞分化的心肌細胞后發生心律失常的風險尚未見報道。因此未來的研究需要在體外鑒定分化心肌細胞的成熟度。

4 結論與啟示

本研究結果表明，在大鼠心肌梗死模型中，誘導多能干細胞分化的心肌細胞移植治療可以通過旁分泌作用減小梗死面積及增加梗死區域毛細血管的密度，從而改善心功能。但如何提高分化心肌細胞成熟度、如何提高移植效率、移植細胞長期存活率和移植后對宿主心臟電活動的影響需以后進一步研究。