磁共振擴散張量成像定量評價消炎液微創治療非壓迫性腰椎神經根炎*

楊朝炳 呂賽群 彭濤 牛翔科 植彪 肖建明

(成都大學附屬醫院放射科，四川 成都 610081)

近年關于腰椎神經根性疼痛研究[1-3]表明，疼痛原因除了椎間盤突出的機械壓迫外，還包括非機械壓迫因素。隨著腰椎神經根非機械壓迫機制研究的深入，各種非壓迫性腰神經根性疼痛的介入微創治療得到了飛速發展，患者獲益良多，但患者預后定量評估方法有限。磁共振擴散張量成像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)能顯示神經根走行及量化分析，并能定量評估水分子在組織中的擴散運動[4-6]。腰椎神經根的水分子橫向擴散受纖維束多層膜結構的限制，縱向擴散卻不受影響，而DTI中的FA值能定量測定水分子在神經纖維束的各向異性值，由此可評價纖維束膜結構的完整性。因此，DTI在外周神經系統的應用越來越廣泛并取得了良好的效果[7]。本研究探索磁共振擴散張量成像技術能否定量評估實驗豬腰椎非壓迫性神經根炎消炎液微創治療的療效，為進一步的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康普通級雌性巴馬小型豬共6只，體質量20 kg左右，無跛行，實驗前經CT及MRI檢查，排除胸腰段脊柱相關疾病。由成都達碩實驗動物有限公司提供(生產許可證號：SCXK(川)2013-24)，同時實驗進程中的動物飼養工作亦由該公司承擔(四川省實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2014-189)。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

1.2 MRI檢查及圖像處理與測量

1.2.1 檢查前準備 檢查前實驗動物禁食8 h，禁飲4 h。常規消毒后，肌內注射氯胺酮約300 mg，待進入麻醉狀態后，于耳后靜脈穿刺靜脈留置針，并持續靜脈滴注氯胺酮混合液(氯胺酮600 mg+地西泮20 mg+500 mL生理鹽水)維持麻醉。實驗過程中，密切關注實驗動物的一般情況，評估麻醉深度：如因麻醉過淺而不自主運動，可肌內加注氯胺酮100 mg；如因麻醉過深而呼吸抑制，可減緩滴注速率。

1.2.2 檢查序列及參數 使用SIEMENS AVANTO 1.5T超導型磁共振掃描儀進行檢查，使用8通道相控陣脊柱線圈，采取仰臥位、頭先進方式固定實驗動物，動物中線置于線圈中心，身體長軸平行于主磁場長軸。掃描前進行勻場，然后進行T2WI序列、DTI掃描。T2WI序列：采用可變翻轉角的自旋回波序列(spcR)矢狀位掃描，TR/TE：2000/117 ms，視野(FOV)250×250 mm，層厚1 mm，層間距0，層數88，平均次數2次，分辨率256×254，相位編碼方向：H-F，并行因子2，翻轉角150°，帶寬399。DTI：采用單次激發自旋回波平面成像序列(SE-EPI)橫斷位掃描，TR/TE：12000/117 ms，視野(FOV)200×200 mm，層厚3 mm，層間距0，層數48，平均次數5次，分辨率132×132，相位編碼方向：A-P，并行因子2，帶寬996，彌散方向12，b值0、800。

1.2.3 MRI圖像處理與測量 圖像的后處理工作在SIEMENS工作站進行，運用neuro 3D(MR)軟件進行后處理，先將T2解剖圖像進行多平面重建，然后將重建后的多平面圖像與DTI進行融合，定義參數：b0閾值為60～1353，Diffusion Map閾值0～1000，b值為800。結合橫斷位T2解剖圖像輔助定位進行神經根FA值的測量。測量每根神經根的三個節段，并取其平均值的方法，盡量減小測量誤差。感興趣區(Region of interest，ROI)的大小為12～28 mm2(18.3±7.6 mm2)。ROI放置位置分別為L2～3、L3～4、L4～5雙側神經根椎間孔外段、椎間孔內段及椎管內段的中央區域，測量范圍應避免超出所測量的神經根截面，并盡可能多的包含神經根。

1.3 非壓迫性神經根炎造模及微創介入治療

1.3.1 非壓迫性神經根炎造模 磁共振檢查完成后，繼續保持實驗動物麻醉狀態，將實驗動物移至CT檢查床俯臥位固定，對術區進行常規備皮、消毒、鋪巾，在CT引導下用17 cm 19G巴德針穿刺L2～3、L3～4、L4～5椎間盤髓核，連接電動經皮椎間盤旋切器(Stryker instruments，USA)進行椎間盤髓核的旋切，旋切器推進速率為0.5～1 mm/s，每個椎間盤旋切出約1.0 g椎間盤髓核組織，將椎間盤髓核組織置于無菌器皿加入生理鹽水，制備成混懸液約12 mL備用。通過CT引導穿刺，分別注入2 mL上述混懸液于L2～3、L3～4、L4～5雙側椎間孔硬膜外腔神經根周圍，并避免刺傷神經根，從而建立神經根非壓迫性損傷模型。造模完成后，在造模術后當天及第2、4天肌注青霉素G 33000 U/kg，預防術后感染。將實驗動物繼續常規飼養，密切觀察其一般情況及活動時肢體情況。

1.3.2 微創介入治療 造模成功14天后，將實驗豬隨機分為實驗組(消炎液治療)與對照組(生理鹽水治療)。同樣用上述方法麻醉、磁共振檢查及CT導向下穿刺實驗動物L2～3、L3～4、L4～5雙側椎間孔。在實驗組動物每根神經根周圍注射消炎液10 mL(曲安奈德120 mg、利多卡因30 mL、維生素B12 6 mg制成溶液共約72 mL)，在對照組動物每根神經根周圍注射生理鹽水10 mL。同樣用造模術后的方案肌注青霉素G預防術后感染及密切觀察動物情況。

1.4 神經根組織免疫組化檢查

1.4.1 標本取材 兩組隨機各取1只試驗豬于相應取材時間點(治療后3、7、14 d)再次按前述方法麻醉及磁共振檢查后，麻醉狀態下處死并解剖出L2～3、L3～4、L4～5雙側神經根近段，然后置于4%多聚甲醛固定液并標記。取材方法：持續麻醉狀態下，采用仰臥位，將實驗動物固定于手術臺上，沿左側胸骨旁線剪開胸壁，充分暴露心臟并鈍行分離心包，于心尖向左心室內快速注射100 mL生理鹽水，然后剪開右心耳，再次于心尖快速注射生理鹽水100 mL及10%中性甲醛固定液200 mL。使甲醛固定液通過血液循環快速到達神經根周圍。待動物呼吸心跳停止后，將動物取俯臥位，逐層剝離腰背部皮膚、肌肉并取去T11～L5節段脊柱，再用骨鉗咬斷L1～5雙側椎板，從后方打開椎管并充分暴露脊髓及雙側神經根，分別剪取7～10 mm L2～3、3～4、4～5雙側神經根近段，并固定、標記送免疫組化檢查。

1.4.2 免疫組化(S-P法) ①一抗：TNF-α，兔多克隆抗體，批號：ab6671，英國abcam--艾博抗(上海)貿易有限公司。②二抗：生物素化山羊抗兔IgG(H+L)，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。③三抗：辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。④封閉用正常山羊血清，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。⑤顯色劑：濃縮型DAB試劑盒，批號：K135925C，北京中杉金橋生物有限公司。

1.4.3 免疫組化步驟 先將載玻片防脫片處理、切片常規脫蠟至水、熱修復抗原，然后滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；再滴加稀釋的一抗(1：200)，4℃過夜；再滴加二抗，37℃ 30 min；再滴加三抗，37℃ 30 min。經DAB室溫顯色2 min，蒸餾水洗滌后蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.4.4 免疫組化圖像采集及評價 采用BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統對切片進行400倍圖像采集。神經根TNF-α蛋白的平均光密度測定使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統。

1.5 統計學分析 運用IBM SPSS Statistics Ver.21統計軟件，采用一維組間方差分析(one way ANOVA)統計方法進行數據處理和分析。先分別比較兩組實驗動物組間及組內造模前、治療前、治療后各時間點神經根平均FA值的差異及變化；再分別比較兩組治療后不同時間點組內神經根TNF-α蛋白含量變化及相同時間點組間神經根TNF-α蛋白含量差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經根平均FA值

2.1.1 造模前后兩組神經根平均FA值 造模前實驗組神經根平均FA值為(0.476±0.150)，對照組神經根平均FA值為(0.394±0.115)。兩組間造模前神經根平均FA值比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。造模后實驗組神經根平均FA值為(0.214±0.084)，對照組神經根平均FA值為(0.180±0.061)；兩組間造模后神經根平均FA值比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。與造模前相比，兩組實驗對象造模后神經根平均FA值均出現減小(P<0.05)。

表1 造模前兩組實驗豬神經根平均FA值表Table 1 Average FA values of nerve roots in the two groups before modeling

表2 造模后兩組實驗豬神經根平均FA值表Table 2 Average FA values of nerve roots in the two groups after modeling

2.1.2 治療后各時間點兩組神經根平均FA值 與治療前(造模后)相比，實驗組治療后3、7、14 d神經根平均FA值均升高(P<0.05)，且與造模前比較差異無統計學意義(P>0.05)；而對照組治療前后神經根平均FA值比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后各時間點實驗組神經根平均FA值均較對照組高(P<0.05)，見表3。

表3 治療后兩組實驗豬神經根平均FA值表Table 3 Average FA value of nerve root in the two groups after treatment

2.2 治療后兩組各時間點神經根TNF-α蛋白含量 與治療后3天相比，實驗組治療后7、14 d神經根TNF-α蛋白含量降低(P<0.05)；而對照組治療后3、7、14 d神經根TNF-α蛋白含量比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后7、14 d實驗組神經根TNF-α蛋白含量均較對照組明顯降低(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 治療后兩組實驗豬神經根TNF-α平均光密度表Table 4 The mean optical density of TNF-α in nerve roots of the two groups after treatment

圖1 神經根DTI測值及免疫組化圖Figure 1 DTI and immunohistochemistry of nerve roots注：A.對照組治療前FA值；B.實驗組治療前FA值；C.對照組治療后7天L4～5右側神經根HE染色圖；D.對照組治療后7天FA值；E.實驗組治療后7天FA值；F.實驗組治療后7天L4～5右側神經根HE染色圖

3 討論

傳統研究認為腰椎神經根性疼痛的原因是由腰椎間突出的機械壓迫導致的，然而近年來的研究認為，神經根性疼痛除了機械壓迫，還包括非壓迫性因素[1-3]。Marshall[8]首次提出化學性神經根炎是由于纖維環破裂和椎間盤液沿神經根鞘擴散而引起的神經根炎癥。Sun等[9]進一步研究認為椎間盤髓核屬于無血液供應組織，獨立于人體免疫系統之外，在體內具有免疫原性，椎間盤突出患者中，由于纖維環斷裂髓核組織突出于椎管內，從而暴露于免疫系統中可導致自身免疫反應，從而導致化學性炎癥。Peng等[10]通過非壓迫性神經根痛的臨床病例證實，化學性神經根炎所致臨床病理疼痛現象存在。因此影像檢查中突出的椎間盤未壓迫神經根，而臨床出現神經病理性疼痛，神經根組織免疫組化檢查中也出現炎性反應及炎癥因子即能診斷該疾病。同時，有研究表明，髓核組織本身就含有多種致炎因子，包括TNF-α、IL-1a等，其中TNF-α在炎癥的發生過程中扮演重要作用，神經病理性疼痛與其濃度高低呈正相關[11-12]。神經根受壓的無疼痛患者神經根FA值反而無變化[13]，表明神經根FA值可能是闡明神經根病病理機制的潛在工具。本研究以神經根中TNF-α蛋白含量為參考標準，以反映神經根炎治療過程中的轉歸及與神經根平均FA值的相對應關系，從而評價非壓迫性腰椎神經根炎消炎液微創治療的療效。

Balbi等[14]研究表明腰椎椎間盤突出患者受壓患側神經根較健側及健康志愿者相對應節段神經根FA值減低。本研究同樣發現造模后FA值較減低，推測其原因可能是由于神經根暴露于髓核組織中發生自身免疫性炎癥、化學性炎癥，神經發生沃勒變性，神經髓鞘及外周多層膜結構的完整性被破壞、通透性增加，水分子在神經橫軸方向擴散運動增加，神經根的各向同性增加，各向異性減小，因此FA值降低[15]；治療后神經的遠端軸索再生、新生的軸索密度增加，水分子在神經縱行方向擴散運動增加，FA值也隨之升高[16]。

細胞因子是一類由多種細胞產生并分泌到胞外的糖蛋白分子，具有多種生物學功能，其中TNF-α在根性神經痛方面發揮重要作用。神經根發生自身免疫性炎癥及化學性炎癥后，各種炎性細胞因子及其他炎癥介質的參與，導致神經根TNF-α蛋白含量增高[17]。本實驗中用自體髓核造模誘發神經根炎后，將消炎液注入神經根周圍治療，主要治療藥物是曲安奈德，為腎上腺皮質激素類藥，該類藥品用于治療腰椎神經根性疼痛得到廣泛認可，其機制可能為減少前列腺素的合成，維持細胞膜的穩定，從而抑制痛覺C纖維的傳導沖動[18]；同時也有助于神經根損傷的修復，通過調節合成bFGF，從而促進神經根功能的恢復，還能降低毛細血管的通透性，減輕水腫，抑制炎癥浸潤，從而使 TNF-α的合成和釋放減少[19]。有研究證實神經根鞘內外局部使用糖皮質激素治療后血液中TNF-α明顯降低[20]；而且曲安奈德也能有效治療神經損傷后的根性疼痛[21]。

有研究表明神經根FA值與TNF-α平均光密度存在負相關關系[22]。Eguchi 等[23]通過研究腰椎間盤突出癥患者發現受壓迫神經FA均值明顯低于未損傷神經，術后患處神經根FA值顯著升高，且FA值和神經癥狀的嚴重程度之間存在很強的相關性。本實驗研究結果也印證了消炎液治療后神經根TNF-α蛋白含量均較對照組明顯降低，神經根的FA值也較治療前及對照組升高，且與造模前比較差異無統計學意義(P<0.05)。這提示擴散張量成像可用于非壓迫性椎間盤突出所致神經根自身免疫性炎癥、化學性炎癥以及治療后炎癥轉歸的評估[24]，并能提供定量信息以評估神經根完整性及病理生理改變[25]，同時腰椎非壓迫性神經根炎能在此種配伍的消炎液微創治療中獲益。

本研究的不足之處：①僅對每只實驗動物相鄰節段的多組神經根同時進行實驗，可能會造成相互干擾，對實驗數據造成影響。②實驗動物樣本量較少，且部分神經根為同一實驗對象，統計結果可能會有偏差。③FA值ROI的放置可能會受人為的測量誤差影響。④只使用一種消炎液的配伍，未對其他配伍的藥物進行比較。⑤本研究為動物實驗研究，未對實驗對象痛覺、行動能力等主觀治療轉歸進行評估。

4 結論

本實驗結果表明，CT導向下消炎液微創治療腰椎非壓迫性神經根炎有效，磁共振擴散張量成像能在不同時間點定量監測神經根炎的轉歸及評價手術治療療效。