p38MAPK介導的TGF-β1與BMP-7在泡型肝包蟲病纖維化中的表達*

李棟 朱海宏 陳敏 楊效

(1.成都京東方醫(yī)院，四川 成都 610200；2.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810000)

泡型肝包蟲病是一種慢性的寄生蟲感染性肝臟疾病，大多數(shù)患者分布于西北牧區(qū)，主要是因為食用生食而導致多房棘球蚴感染[1-3]，在我國其發(fā)病率受地域影響較重。在臨床工作中可見部分患者病灶周邊肝臟發(fā)生纖維化，影響肝臟術后代償功能，降低預后效果。目前國內外對肝纖維化的研究主要集中在炎性刺激因子[4-6]如腫瘤壞死因子、白細胞介素等，其中轉化生長因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)的致肝纖維化作用也基本達成共識，其可啟動肝星狀細胞的活化，促使肝星狀細胞轉化成為成纖維細胞，進而分泌大量細胞外基質，細胞外基質的病態(tài)積累引發(fā)肝纖維化形成[7-8]。有相關研究[9-11]顯示，在乙肝病毒、酒精性肝炎導致的肝纖維化中，絲裂原活化蛋白激酶所屬的p38MAPK信號通路發(fā)揮了明顯的促肝纖維化功效，其可將真核細胞胞外分子信號轉至胞內引起細胞反應，在細胞生長、增殖、分化和凋亡等細胞反應的傳導中起重要作用，另外可通過傳遞TGF-β1的生物學信號而發(fā)揮功能。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)屬轉化因子超家族成員，其有較強的成骨作用外[12]。有研究[13-15]顯示BMP-7在心肌及腎臟纖維化中發(fā)揮了重要的抗纖維化作用，其可影響TGF-β1的致纖維化作用。因此本課題組將目標鎖定在p38MAPK、TGF-β1、BMP-7的研究上，通過完善基礎機制研究進一步反饋臨床應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2017年9月～2018年11月在青海省人民醫(yī)院診療的40位患有泡型肝包蟲病患者。病例均為病檢明確診斷患者，排除其他理化因素導致的肝臟纖維化患者及不同類型肝炎患者。收集術后切除下的肝臟標本。標本厚度一般超過0.5 cm，一份行經(jīng)行染色，另一份液氮中迅速冷凍后轉移至-80℃冰箱予以保存。樣本采集經(jīng)過患者知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委會員批準。

1.2 儀器 臺式常溫/低溫離心機、移液槍、超凈工作臺、-80℃低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)，快速混勻器、液氮罐10 L、高壓滅菌鍋、研磨碗/研磨杵(常州申光儀器有限公司)，恒溫箱(華電公司)，PCR儀、Nanodrop2000濃度檢測儀、熱循環(huán)儀(Roche公司)，超純凈水器、切片機、顯微鏡、載玻片。

1.3 試劑 液氮(西寧液氮公司)，細胞裂解液Trizo、DEPC水、逆轉錄試劑盒、無水乙醇、4%甲醛、石蠟、氯仿、異丙醇、二甲苯、PCR引物(生信)，HE及Masson染色劑盒(萊寶生物公司)。

1.4 實驗分組 根據(jù)采集部位分為病灶組(病灶邊緣)、距病灶邊緣≤2 cm組(距病灶邊緣≤2 cm)和距病灶邊緣>2 cm組(距病灶邊緣>2 cm)。按照HE及Masson染色結果，對上述三組標本進行纖維化分級，分級標準knodell[16](表1)。將纖維化分級標本進一步分為S0纖維化組、S1纖維化組、S2纖維化組、S3纖維化組。其中S0組既無明顯纖維化組設為實驗對照組，S1、S2、S3三組分別設為目標組。

表1 knodell分級標準Table1 Knodell grading standard

1.5 HE染色及Masson染色 根據(jù)HE染色及Masson染色試劑盒說明書操作步驟，按照順序逐步完成染色，隨后顯微鏡觀察各組標本染色情況。

1.6 qRT-PCR檢測mRNA表達水平 將在液氮中冷凍標本研磨成細粉狀后，加入細胞裂解液然后放置10 min；在4℃低溫環(huán)境下經(jīng)12000轉離心10 min，將上清轉移到無酶離心管中，在離心管中加入200 μL氯仿，密封完畢后，混合均勻，室溫靜置5 min，再次12000 r，15 min，4℃離心處理，離心完畢后，目標RNA大部分溶解在水相層中，小心吸取500 uL無色水相層移入1.5 mL無酶離心管，加入相同體積異丙醇，放置20 min，再次離心處理，棄除上清夜，保留沉淀，加入75%乙醇，洗滌雜質。RNA質量及濃度檢測：利用分光光度計檢驗RNA濃度及純度是否合格。總體積：20 μL(RNA6.0 μL、5×Fastking-RT SuperMix 4.0 μL、ddH2O 10.0 μL)。42℃ 15 min 去除基因組及反轉錄反應、95℃ 3 min酶滅活。擴增反應及條件：2×SuperReal Color PreMix 10.0 μL、正向引物0.6 μL、反向引物0.6 μL、cDNA模板 1.0 uL、ddH2O 7.8 μL。引物序列(TGF-β1：正向5′-ttggcctgccaaacgacttcgg-3′，反向r5′-cgcggcgggatagcgctcct-3′；P38：正向5′-tccaaaggctactccgaatc-3′、反向5′-tgtttcaggtaaaggtgagc-3′；BMP-7：正向5′-GTGGTCAACCCTCGGCACA-3′、反向5′-GGCGTCTTGGAGCGATTCTG-3′ )miRNA擴增(預變性，95℃ 15 min ；變性，95℃，10 s：退火 62℃ 30 s)。相對表達量用2-ΔΔCt表示。

2 結果

2.1 HE染色及Masson染色結果 根據(jù) HE染色及Masson染色結果，病灶邊緣大部分為S2度纖維化，距病灶邊緣<2 cm范圍內大部分為S1度纖維化，距病灶邊緣>2 cm肝組織主要為S0度纖維化既無明顯纖維化的正常肝組織，見圖1、表2。

圖1 HE染色及Masson染色結果(40×)Figure 1 HE staining and Masson staining results

2.2 距病灶邊緣不同距離肝組織纖維化分級 根據(jù)HE染色及Masson染色結果，將各部位肝組織按照knodell標準進行肝纖維化分級，病灶邊緣大部分為S2度纖維化，距病灶邊緣<2 cm范圍內大部分為S1度纖維化，距病灶邊緣>2 cm肝組織主要為S0度纖維化既無明顯纖維化的正常肝組織，見表2。

表2 不同部位肝組織纖維化分級(n)Table 2 Fibrosis grading of liver tissue at different distances from the edge of lesion

2.3 在泡型肝包蟲病纖維化肝組織中TGF-β1、p38、BMP-7的相對表達情況 與S0纖維化組，S1、S2及S3纖維化組肝組織中TGF-β1的相對表達量表達升高，隨著纖維化的不斷加重，表達量逐漸顯著，在S3纖維化組中表達最高，各組間表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p38在S1、S2及S3纖維化組的異常表達傾向，與TGF-β1在泡肝纖維化中的走勢高度相似，均較S0組表達明顯，纖維化程度越重表達量越高，在S3纖維化組中表達最高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在S1、S2和S3纖維化組中BMP-7的相對表達走向與p38及TGF-β1明顯不同，表達最高為S2纖維化組，在S3纖維化組中的表達有下降趨勢，各組間異常表達情況具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 TGF-β1、p38、BMP-7的相對表達情況Table 3 Relative expression of TGF-β1，p38 and BMP-7

2.4 TGF-β1與p38及BMP-7相對表達量的相關分析 通過綜合分析TGF-β1、P38、BMP-7在各組中相對表達量的潛在關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1與p38在的異常表達情況呈正性相關(r=0.566P<0.01)，見圖2。通過綜合三組實驗組中 TGF-β1與BMP-7的相對表達情況，發(fā)現(xiàn)TGF-β1與BMP-7的異常表達量呈負性相關(r=-0.349，P<0.01)，見圖3。在泡肝纖維化中，p38與BMP-7的相對表達無相關性(r=-0.17，P>0.05)，見圖4。

TGF-β1相對表達量圖2 TGF-β1與p38相關性分析Figure 2 Correlation analysis between TGF-β1 and p38

TGF-β1相對表達量圖3 TGF-β1與BMP-7相關性分析Figure 3 Correlation analysis between TGF-β1 and BMP-7

p38相對表達量圖4 p38與BMP-7相關性分析Figure 4 Correlation analysis between p38 and BMP-7

3 討論

目前，關于肝泡型包蟲病的研究表明病灶周圍肝組織存在不同程度的纖維化，有研究學者采用HE染色證實，在泡肝所致的纖維化中，距病灶5 cm范圍內大部分染色結果為S2度纖維化，超過5 cm范圍外的染色結果基本均為S0度纖維化[17]。本課題進一步通過HE染色結合Masson染色證實發(fā)現(xiàn)纖維化的顯著程度與病灶距離有明顯的相關性，在2 cm范圍內肝組織纖維化比較明顯，大多為S2度纖維化。研究結果與大部分其他學者泡肝纖維化的研究類似。

本課題進一步通過檢測BMP-7、p38、TGF-β1在不同纖維化級別中的異常表達趨勢，發(fā)現(xiàn)其中p38與TGF-β1的表達走向較為類似，在各級纖維化組中均異常表達，在S3纖維化組中表達最為活躍，其次為S2、S1度纖維化組，從表達曲線上可發(fā)現(xiàn)，p38與TGF-β1的表達活躍度與纖維化嚴重程度呈正相關性。另通過進一步處理實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，p38與TGF-β1的相對表達情況成中度正相關性。通過上述實驗及其他學者研究結果可推測，p38與TGF-β1在泡肝纖維化的演變中發(fā)揮了重要的促纖維化效力，TGF-β1生物信號的傳遞與p38MAPK介導通路息息相關[18-19]。但進一步查找相關研究報道顯示，泡球蚴分泌的囊液未展現(xiàn)出足夠的生物效應可促進激肝星狀細胞增加TGF-β1的表達及活化[20]，從而進一步推測，泡肝纖維化可能與其他類型肝纖維化有類似的發(fā)展機制，主要還是因長期理化刺激破壞肝細胞所致。BMP-7在泡肝纖維化中較其他兩個細胞因子具有明顯的特征，其并非一味地隨著纖維化的加重而大量表達，反而在S2度級纖維中表達最為突出，在S3及纖維化中有表達水平降低的趨勢。另綜合分析BMP-7與TGF-β1的異常表達結果發(fā)現(xiàn)，二者間有一定程度的負相關，二者之間可能存在互相拮抗效應，BMP-7與TGF-β1之間可能存在某種相互作用的機制，一旦某種外來因素導致TGF-β1的表達占優(yōu)時，打破二者間的平衡變化，參與泡肝纖維化的演化。本實驗通過分子維度探索泡型肝包蟲纖維化的演化機制，為后續(xù)研究提供了一定潛在方向與思路。BMP-7的生物潛力還需進一步激發(fā)探索，為肝纖維化的逆轉提供可能。

4 結論

本研究顯示，TGF-β1的促肝纖維化信號可通過p38MAPK介導通路可轉導TGF-β1生物信號而發(fā)揮促纖維化生物效應；BMP-7在泡型肝包蟲纖維化肝組織中異常表達與TGF-β1之間可能存在某種動態(tài)平衡關系，表達失衡可能加劇泡肝纖維化的演化發(fā)展。