AI技術在乳腺原位癌Ki67染色切片定量檢測中的應用價值

沈苗 嵇學仙 謝紅芳 姚根新 毛建英 潘建強 陳國群

我國乳腺癌的發病率占女性腫瘤的第1位，嚴重危害女性的身心健康［1］。Ki67是預測乳腺癌患者預后較為重要且可靠的標志物，Ki67高比例表達是預后的不良因素［2］。目前，我國大多數醫院的病理科醫師仍以顯微鏡目測評價Ki67指數，人為主觀性大。有效提高乳腺原位癌Ki67定量檢測的準確性是研究者的共同目標。本文探討人工智能（AI）技術在乳腺原位癌Ki67染色切片定量檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧分析2013年1 月至2021年1月本院乳腺原位癌樣本110例，年齡36～84歲，平均年齡（52±4.5）歲。其中乳腺導管原位癌92例，占比83.6%（見圖1、2），乳腺導管內乳頭狀癌11例，占比10%（見圖3、4），乳腺實性乳頭狀癌7例，占比6.4%（見圖5、6）。所有Ki67免疫組化由有資質的病理專業醫師作出判讀后再進行AI檢測。

圖1 乳腺導管原位癌（HE×100倍）

圖2 乳腺導管原位癌（Ki67×100倍）

圖3 乳腺導管內乳頭狀癌（HE×100倍）

圖4 乳腺導管內乳頭狀癌（Ki67×100倍）

圖5 乳腺實性乳頭狀癌（HE×100倍）

圖6 乳腺實性乳頭狀癌（Ki67×100倍）

1.2 方法 （1）組織標本的制備：選擇乳腺導管原位癌的蠟塊制備成 3μm 厚的切片免疫組化染色。免疫組化染色試劑盒和Ki67單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒，購自福建邁新生物技術有限公司。（2）免疫組化檢測［3］：乳腺原位癌標本免疫組化采用 En Vision二步法檢測 Ki67 蛋白的表達情況，以TBS代替一抗作陰性對照，以試劑盒陽性片作陽性對照。選取經蘇木精－伊紅（HE）染色驗證的乳腺原位癌組織石蠟塊，切出石蠟3μm，將其放到載玻片上，以60℃烤片4 h；2次二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水后進行水洗；修復抗原，蒸餾水沖洗，5 min×3次；3% H2O2溶液處理15 min，PBS沖洗，5 min×3次；一抗4 ℃孵育12 h，PBS沖洗，5 min×3次；二抗25℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；DAB室溫下3～5 min顯色，蘇木素復染1～2 min細胞核，以梯度乙醇脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠進行封片，在鏡下觀察。每張切片由2位病理專家獨立閱片共同協商出判斷結果。

1.3 判斷標準 （1）Ki67陽性判定標準：Ki67 蛋白陽性染色定位于細胞核，顆粒呈棕黃色。每張切片觀察5個具有代表性的視野（×400），每個視野計數100個細胞，計算Ki67陽性細胞數占細胞總數的比例［4］。參考NCCN指南及多項研究報道，包括浸潤性和非浸潤性乳腺癌，選擇14%作為Ki67表達的臨界值，將乳腺原位癌病例分為Ki67比表達組（≤14%）和高表達組（＞14%）［5～6］。

1.4 AI檢測 （1）AI和圖像定量分析相結合對乳腺原位癌Ki67切片的掃描分析。AI系統采用浙江賽爾微因公司生產的數字化智能細胞組織病理圖像分析軟件。制作的免疫組化Ki67片使用寧波江豐公司的數字圖片掃描技術。整個過程采用產品說明書操作。（2）110例乳腺原位癌Ki67病例，用該軟件的乳腺原位癌Ki67切片掃描成像并圈出癌癥區域。掃描10個熱點區域得出的平均數值后得出結果。然后將這些數字圖像匯集，存入數據庫中。軟件在后期分析圖像時，會使用數據庫中的圖像數據。若軟件在分析時，出現癌癥區域漏圈或錯圈，則由醫師進行標注漏圈和錯圈部分，再存入數據庫中進行訓練，以此達到完善數據的目的。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0統計學軟件。計數資料用%表示，用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 110例乳腺原位癌Ki67樣本檢測結果 見表1。

表1 110例乳腺原位癌Ki67樣本檢測結果

表1 （續）

2.2 Ki67＞14%與Ki67≤14%的 檢 測 結 果 比較 Ki67＞14% AI閱片與人工閱片陽性比例差異有統計學意義（P＜0.05），AI閱片有更高的敏感性。Ki67≤14% AI閱片和人工閱片陽性比例差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 Ki67＞14%的檢測結果比較

2.3 閱片時間 Ki67人工閱片每例平均時間12.7 min。AI閱片每例平均時間10.9 min，二者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 Ki67≤14%檢測結果比較

3 討論

乳腺癌是一種極具異質性的疾病，即使同種分子分型的乳腺癌也有完全不同的預后。乳腺癌相同的期別也具有不同的生物學特性［7-8］。乳腺原位癌是乳腺癌的早期病變。通過手術切除，經正規藥物治療等綜合治療，效果確切，可達到痊愈目的，且較少出現復發和轉移。乳腺原位癌如果不進行治療，進一步可發展為乳腺浸潤性癌，其治療以手術，放化療，靶向治療為主，預后及患者生存時間較差。

針對預后靶點的治療與防治能夠顯著提升患者預后及治療效果。已有研究顯示，Ki67作為乳腺癌病理診斷的分子標志物，是敏感度較好的獨立指標［9］。DE等［10］Meta分析顯示，Ki67陽性表達的腫瘤細胞惡性程度高，增殖活躍，腫瘤生長速度快，侵襲及轉移率高，預后差。近年來，AI技術應用于病理圖像分析日益成熟［11］。有文獻提示AI閱片檢測結合人工閱片后提高篩查的敏感性同時保證特異性并明顯提高工作效率［12］。本資料結果顯示，Ki67＞14% 43例：AI閱片和人工閱片陽性比例差異有統計學意義（P＜0.05）。AI閱片有更高的敏感性。Ki67≤14% 67例：AI閱片和人工閱片陽性比例差異無統計學意義（P＞0.05）。AI獨立使用于乳腺原位癌Ki67的篩查尚不成熟。

借用AI的識別和深度學習能力，幫助醫師審片更加精準高效。AI在病灶區域識別速度上勝于人工操作，同時也有利于對Ki67的定量檢測進行量化，使得檢測結果更加精準，為后續對乳腺原位癌的治療方案提供客觀的病理診斷依據。有利于臨床醫師制定針對性的治療方案。

因此，乳腺癌原位癌Ki67染色切片定量檢測中的熱點確定對實現大數據進而實現人工智能有著深遠意義。隨著計算機技術的進步及更大數據庫的建立使用，AI技術將有更廣闊的應用前景。