發(fā)酵小米工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

葛迎港，趙博凱，王曉聞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801）

0 引言

納豆是一種源于中國(guó)的天然發(fā)酵食品，是大豆經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成的健康食品，許多研究表明，在發(fā)酵的納豆中具有很多生理調(diào)節(jié)功能[1]，如溶血栓、降血壓、抗菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的納豆激酶，具有凝血、激活人體血栓溶解系統(tǒng)的功能[2]，有研究表明其提取物能顯著緩解高果糖誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受癥、高胰島素血癥和血脂障礙等生理疾病[3]。

小米是一種優(yōu)質(zhì)的雜糧資源，其蛋白質(zhì)含量在11.43%~13.72%，氨基酸含量豐富[4]；因其高膳食纖維、低血糖生成指數(shù)（GI） 的特性被廣泛應(yīng)用于健康食品的開發(fā)中[5-6]；又因其抗干旱、產(chǎn)量高、容易管理的特性被廣泛種植。在國(guó)外有食用發(fā)酵的習(xí)慣，如小米稠粥、塞拉米，這些都是通過微生物發(fā)酵小米來達(dá)到改善小米的口感和風(fēng)味的目的[7]。在國(guó)內(nèi)，通過對(duì)發(fā)酵小米糠[8-9]和酶解小米分離蛋白[10]來獲得的抗氧化多肽；同時(shí)，也有依托地區(qū)特色食品為藍(lán)本利用乳酸菌來發(fā)酵小米，分離具有抗菌活性的多肽[7]。在食品加工中氧化是一個(gè)影響食品品質(zhì)的重要過程，其對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、安全都有重要影響[11-12]，在氧化過程中產(chǎn)生的自由基與人體細(xì)胞損傷密切相關(guān)[13]。體外評(píng)價(jià)抗氧化能力化學(xué)指標(biāo)法和細(xì)胞試驗(yàn)法，化學(xué)指標(biāo)法因具有快速方便、成本低的特征，被廣泛應(yīng)用于初期的抗氧化研究。測(cè)試方法有自由基清除法、氧化還原法和脂質(zhì)過氧化抑制法。通過對(duì)不同條件下發(fā)酵小米中抗氧化活性和蛋白質(zhì)含量變化，為發(fā)酵小米的提取抗氧化物質(zhì)提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

東方亮1 號(hào)小米，山西東方亮生命科技股份公司提供；黑豆，忻州市匯豐糧業(yè)有限公司提供；小米分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室堿溶酸沉自提。

1.1.2 試劑

牛血清白蛋白（BR）、考馬斯亮藍(lán)G-250（BR）、大豆分離蛋白（BR）、22 - 二- 1 - 苦肼基自由基（BR）、SDS（BR）、ABTS（BR），北京索萊寶科技有限公司提供；其他試劑為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備及儀器

UV-1100 型紫外分光光度計(jì)、SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(tái)、SB25-12DTDN 型超聲波清洗機(jī)、HH·B11·420-BY 型恒溫培養(yǎng)箱、DGL-50GL 型立式蒸汽滅菌器、迷你離心機(jī)、ST-3100 型pH 計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵劑制作

將15 g 黑豆用80 mL 蒸餾水浸泡12 h，煮沸20 min，在超凈工作臺(tái)中，用滅菌的紗布過濾，將黑豆置于100 mL 滅菌的燒杯中用8 層紗布和1 層扎孔的牛皮紙密封，在常溫下避光發(fā)酵，每8 h 補(bǔ)充2 mL 的無菌水并搖動(dòng)通氣，待大豆表面生成大量乳白色黏稠物質(zhì)時(shí)停止培養(yǎng)。

1.2.2 菌懸液的制備

將1.5 g 小米分離蛋白、0.05 g 氯化鈉、0.25 g 葡萄糖和50 mL 蒸餾水混勻加入200 mL 錐形瓶中，6 層紗布密封。于121 ℃下滅菌15 min，再經(jīng)超聲處理10 min，向上述發(fā)酵黑豆中加入10 mL 無菌水，搖勻轉(zhuǎn)移到小米蛋白培養(yǎng)基，于37.6 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h，冷藏保存，每15 d 傳代培養(yǎng)1 次[14]。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵

將5.0 g 小米浸泡12 h，然后與0.01 g 磷酸氫二鉀、0.3 g 大豆分離蛋白、5 mL 蒸餾水混勻，高壓滅菌完成的固態(tài)培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)，先加入適量無菌水，保持基質(zhì)含水量在60%左右，用無菌玻璃棒把結(jié)塊的小米充分?jǐn)囁椋瑩u勻接入菌懸液。接種時(shí)保證菌懸液與無菌水共3 mL，然后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h 用2 mL 無菌水潤(rùn)濕紗布并搖動(dòng)錐形瓶通氣。

1.2.4 小米發(fā)酵單因素試驗(yàn)

在溫度37 ℃，接種量6%，pH 值7 條件下發(fā)酵24 h，以提取液中蛋白和清除自由基能力作為指標(biāo)，研究最佳發(fā)酵條件。分別研究發(fā)酵時(shí)間為0，12，24，36，48 h；發(fā)酵溫度為31，33，35，37，39 ℃；基質(zhì)pH 值為5，6，7，8，9；接種量為0，3%，6%，9%，12%對(duì)發(fā)酵的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、初始pH 值和接種量4 個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，利用綜合平衡法對(duì)2 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析篩選最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 不同時(shí)間下發(fā)酵對(duì)照試驗(yàn)

在最優(yōu)解的基礎(chǔ)上測(cè)試不同時(shí)間0，12，24，36，48 h 下接種與未接種小米基質(zhì)抗氧化能力變化。

1.2.7 蛋白含量的計(jì)算

（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。參照文獻(xiàn)[15-16]的方法，稍作改進(jìn)。取6 支試管分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的0.1 mg/mL 牛血清蛋白，用鹽酸-氯化鈉緩沖液補(bǔ)足2 mL，加入用95%乙醇溶解的考馬斯亮藍(lán)緩沖液3 mL，搖勻在遮光處?kù)o置5 min，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2） 上清液中蛋白含量測(cè)定。隨機(jī)多次取樣1.000 g 的發(fā)酵基質(zhì)于研缽中加入4 ℃下保存的緩沖液（鹽酸—氯化鈉） 8 mL，充分研磨，在低速離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速5 000 r/mim 離心20 min，取上清液用0.22 μm 濾膜（天津·津騰） 過濾得提取液α。在離心管中分別加入0.5 mL 提取液α，1.5 mL 的緩沖液，3 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液充分搖勻，避光反應(yīng)5 min，以不含提取液α 的混合液調(diào)零，在波長(zhǎng)595 nm 處快速測(cè)定其吸光度，以相關(guān)變量為橫坐標(biāo)、基質(zhì)中蛋白含量為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.8 抗氧化能力的測(cè)定

（1） DPPH 自由基清除能力測(cè)定。隨機(jī)多次取樣1.000 g 發(fā)酵基質(zhì)，加入蒸餾水8 mL 充分研磨，在100 ℃下滅酶10 min，低速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速5 000 r/mim離心20 min，取上清液用0.22 μm 濾膜過濾得提取液β。參照文獻(xiàn)[17]中方法稍作修改，將提取液β 0.4 mL 和濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液0.6 mL 加入離心管，然后在振蕩器上快速振蕩搖勻，以轉(zhuǎn)速為7 000 r/mim 離心1 min，在37 ℃下恒溫、避光反應(yīng)30 min，將反應(yīng)完成的混合液加入石英狹縫比色皿中，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定各吸光度。以變量為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)作圖。計(jì)算公式如下：

式中：A樣——加入樣品吸光度；

A對(duì)——用等量蒸餾水代替提取液β 的吸光度；

A空——用無水乙醇取代DPPH 溶液。

（2） ABTS 自由基清除能力測(cè)定。參照Lin Zheng 等人[18]的方法，稍作修改。將7 mmol ABTS 溶解在蒸餾水中并于2.45 mmol 的過硫酸鉀混合。使混合物在黑暗中靜置16 h 產(chǎn)生ABTS 自由基。然后用50 mmol/L，pH 值7.4 的PBS 溶液進(jìn)行稀釋，稀釋到吸光值為0.70±0.02，蒸餾水調(diào)零。然后取提取液β 0.1 mL與ABTS 稀釋液1.9 mL，混合搖勻在黑暗中反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后加入石英狹縫比色皿在波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光度。

式中：A樣——加入樣品吸光度；

A對(duì)——用等量蒸餾水代替提取液β 的吸光度；

A空——用PBS 溶液取代ABTS 稀釋液。

（3） 總還原力的測(cè)定。參照Kadriye I B 等人[19]改良后的鐵氰化鉀法測(cè)定總還原力稍作修改。依次向試管中加入提取液β 0.5 mL，H2O 0.5 mL，1 mol/L HCl 0.75 mL，鐵氰化物溶液（1%，M/V） 0.75 mL，SDS（1%，M/V） 0.25 mL，F(xiàn)eCl3·6H2O 溶液（0.2%，M/V） 0.25 mL 混合搖勻，將混合物在50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，反應(yīng)完成后加入普通比色皿中，于波長(zhǎng)750 nm 處測(cè)定吸光度，用蒸餾水取代提取液調(diào)零。

1.2.9 感官分析

分別從顏色、黏連性、顆粒完整程度、氣味、硬度方面對(duì)不同時(shí)間下接種與未接種的小米進(jìn)行感官分析。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25 進(jìn)行顯著性差異分析，使用Excel 2019 整合試驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，其線性曲線為Y=0.5959X+0.010 6，R2=0.995 2 在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

2.2 小米發(fā)酵單因素結(jié)果分析

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)小米發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響

由圖2 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白含量與DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其原因可能是細(xì)菌分泌胞外酶破壞了小米的細(xì)胞壁，使一部分蛋白被釋放出來，同時(shí)分泌的蛋白酶水解大分子的蛋白質(zhì)和改善蛋白質(zhì)疏水特性。Shuang Yang 等人[20]在利用蛹蟲草發(fā)酵玉米醇溶蛋白發(fā)現(xiàn)發(fā)酵能顯著改善醇溶蛋白的溶解特性。在Haicheng Yin 等人[21]的研究中納豆菌在0~8 h 內(nèi)釋放蛋白酶，其后以羧基肽酶為主。在延莎等人[22]，B.R.Veenashri 等人[23]的研究中小米本身的酚類和多糖具有較好的抗氧化能力。發(fā)酵米糠[8]、板栗[24]、豆粕[25]的研究中表明，時(shí)間是影響發(fā)酵產(chǎn)物的關(guān)鍵因素。在培養(yǎng)12 h 時(shí)其蛋白含量與其他組具有顯著差異（p＜0.05），但是其抗氧化水平顯著低于24 h（p＜0.05），表明其在短時(shí)間內(nèi)其分泌的胞外酶不能徹底水解大分子物質(zhì)。因此，認(rèn)為發(fā)酵時(shí)間為24 h 比較合適的發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 接種量對(duì)發(fā)酵小米的影響

接種量對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響見圖3。

圖3 接種量對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響

接種量主要是在前期影響發(fā)酵進(jìn)程，在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，過多接種會(huì)導(dǎo)致容器氧氣量供應(yīng)不足，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。接種量過少使基質(zhì)中的酶過少不能有效地水解其中大分子物質(zhì)，改善基質(zhì)的抗氧化能力。由圖3 可知，在接種量為6%時(shí)其蛋白含量與其他組有顯著差異（p＜0.05），DPPH 自由基清除能力也顯著（p＜0.05） 高于接種量為0%，3%的基質(zhì)提取液，表明在24 h 內(nèi)發(fā)酵接種量對(duì)基質(zhì)中大分子物質(zhì)分解有較大影響，這與鄺嘉華等人[26]、王鑾[27]報(bào)道結(jié)果一致。因此，接種量6%為適宜的發(fā)酵條件。

2.2.3 基質(zhì)pH 值對(duì)發(fā)酵小米的影響

基質(zhì)pH 值對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響見圖4。

圖4 基質(zhì)pH 值對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響

由圖4 可知，在基質(zhì)pH 值8 時(shí)，其蛋白含量和抗氧化能力要高于中性條件，可能的原因是在微堿性的條件下，有利于蛋白溶出，方便細(xì)菌借助基質(zhì)中氮源快速生長(zhǎng)；當(dāng)基質(zhì)pH 值＞8 時(shí)，其堿性環(huán)境開始抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)和酶的分泌受到抑制。在基質(zhì)pH 值5 時(shí)基質(zhì)蛋白含量顯著（p＜0.05）低于弱堿性下蛋白含量。在酸性的條件下，H+會(huì)與蛋白質(zhì)表面電子結(jié)合，降低其溶解特性。一些研究表明，培養(yǎng)基pH 值會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)成分的運(yùn)輸，如葡萄糖和氮源[25]。在張建萍等人[28]的研究中，pH 值4.5 即可沉淀獲取小米蛋白。因此，認(rèn)為基質(zhì)pH 值8 是最佳發(fā)酵條件。

2.2.4 發(fā)酵溫度發(fā)酵小米的影響

發(fā)酵溫度對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的影響

在微生物的生長(zhǎng)發(fā)育中，主要依靠酶和其相關(guān)的催化反應(yīng)進(jìn)行新陳代謝，而酶的催化活性由溫度決定[20]。由圖5 可知，隨著發(fā)酵溫度上升，基質(zhì)抗氧化能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在低溫和高溫的條件下細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)低溫也會(huì)抑制胞外酶的活性，高溫會(huì)影響酶的結(jié)構(gòu)和改變基因的表達(dá)。在37 ℃培養(yǎng)條件下蛋白含量和自由基清除能力顯著（p＜0.05） 高于低溫條件培養(yǎng)。在39 ℃條件培養(yǎng)與37 ℃并無顯著（p＞0.05） 差異。因此，選用37 ℃為最佳發(fā)酵條件。

2.3 發(fā)酵正交結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)最佳結(jié)果的基礎(chǔ)對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、基質(zhì)pH 值和接種量進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，進(jìn)一步探究這些因素對(duì)抗氧化活性物質(zhì)的影響。

固態(tài)發(fā)酵正交因素水平見表1，固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析見表3。

表1 固態(tài)發(fā)酵正交因素水平

表2 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

由表2 可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)基質(zhì)蛋白含量與自由基清除能力影響最大。對(duì)基質(zhì)蛋白含量影響因素依次為發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、基質(zhì)pH 值，即D＞A＞C＞B。其均值的最大項(xiàng)為其最優(yōu)解。對(duì)于基質(zhì)清除自由基能力影響依次因素為發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度、基質(zhì)pH 值，即D＞C＞A＞B。

由表3 可知，F(xiàn)值判斷可知影響基質(zhì)中蛋白含量因素的依次順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量。對(duì)于DPPH 自由基清除能力影響因素依次為發(fā)酵時(shí)間、接種量，發(fā)酵溫度。其結(jié)果與直觀分析結(jié)果相符合。

固態(tài)發(fā)酵極差與因素最優(yōu)解水平見表4。

表4 固態(tài)發(fā)酵極差與因素最優(yōu)解水平

發(fā)酵時(shí)間D對(duì)兩指標(biāo)的影響：表4 顯示發(fā)酵時(shí)間對(duì)兩指標(biāo)來講極差均是最大，對(duì)于基質(zhì)蛋白含量來講D3水平為最優(yōu)，對(duì)于自由基清除率來講D1水平為最優(yōu)。由單因素結(jié)果分析可知在D3水平下其大分子物質(zhì)水解程度較低，不適合提取抗氧化活性物質(zhì)。基于兩指標(biāo)在不同時(shí)間下多重比較結(jié)果分析D2水平適合最優(yōu)水平。

發(fā)酵溫度A對(duì)于兩指標(biāo)的影響：表4 顯示發(fā)酵溫度對(duì)兩指標(biāo)來講都是第二關(guān)鍵因素，溫度低時(shí)微生物繁殖和酶分解速度下降，溫度過高會(huì)破壞微生物和酶的結(jié)構(gòu)不利于活性物質(zhì)的生成。因此，選擇抗氧化水平較高A2為最優(yōu)發(fā)酵條件。

基質(zhì)pH 值B對(duì)兩指標(biāo)的影響：表4 對(duì)于兩指標(biāo)來講因素B都是最弱的影響因素，多重比較結(jié)果顯示其3 水平下的兩指標(biāo)都沒有顯著性（p＞0.05） 差異。因此，選用B1水平為最佳條件。

通過各因素對(duì)基質(zhì)蛋白含量與DPPH 自由基清除率的綜合分析得出最優(yōu)方案為發(fā)酵時(shí)間24 h，接種量9%，發(fā)酵溫度37 ℃，基質(zhì)pH 值8。

由于正交試驗(yàn)結(jié)果不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，因此利用最佳參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，結(jié)果為DPPH 自由基清除率80%，基質(zhì)蛋白含量3.84 mg/g，其中自由基清除率高于所有正交試驗(yàn)結(jié)果，基質(zhì)蛋白含量高于多少結(jié)果。因此，認(rèn)為此發(fā)酵組合是合理的。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性探究與感官分析

2.4.1 不同時(shí)間下DPPH 自由基清除能力的變化

DPPH 自由基清除能力測(cè)定見圖6。

由圖6 可知，在接種細(xì)菌開始發(fā)酵后，其基質(zhì)的抗氧化能力顯著提高。未接種的小米固態(tài)培養(yǎng)基，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)其抗氧化能力在不斷下降，其中的黃酮、多酚、脂質(zhì)不斷被氧化，使小米的品質(zhì)不斷下降。接種發(fā)酵24 h 后其抗氧化能力顯著（p＜0.05） 高于其他時(shí)間。

圖6 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

2.4.2 不同時(shí)間ABTS+自由基清除能力變化

ABTS+自由基清除能力測(cè)定見圖7。

圖7 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

由圖7 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，接種后其清除ABTS 自由基的能力顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。其在后期自由基清除能力不斷增加，表明有其他還原性物質(zhì)生成，如多糖、多酚。利用發(fā)酵獲取多糖已經(jīng)有較多研究[29-30]。通過發(fā)酵米糠[9]、桑葚[31]、橙子皮[32]來獲取多酚也有報(bào)道。

2.4.3 不同時(shí)間總還原力的變化

總還原力測(cè)定見圖8。

圖8 總還原力測(cè)定

鐵氰化鉀法測(cè)定總還原力可以直接通過吸光度來判斷總還原力的大小，吸光度與還原力呈正相關(guān)。由圖8 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，接種與未接種還原力差距越來越明顯。相對(duì)于用乙醇溶解DPPH 自由基測(cè)定抗氧化能力的大小，總還原力能更好地反映基質(zhì)的整體還原性。后期在基質(zhì)蛋白含量顯著下降的條件下依然保持較高的抗氧化活性，其原因可能是大分子物質(zhì)分解為更小的活性物質(zhì)或者存在發(fā)酵產(chǎn)物的協(xié)同作用[33]。Liang Zhishan 等人[34]在研究葡萄提取物中發(fā)現(xiàn)，其中多酚類化合物存在協(xié)同抗氧化作用。在饒勝其等人[35]的研究中，通過純化的雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。

2.4.4 不同發(fā)酵時(shí)間的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)見表5。

表5 感官評(píng)價(jià)

由表5 可知，經(jīng)過滅菌后小米其品質(zhì)在12 h 內(nèi)不會(huì)發(fā)生顯著（p＞0.05） 變化；在24 h 后其開始快速地腐敗變質(zhì)；在培養(yǎng)箱中保存48 h 后，其有刺鼻的氨氣味，其中腐敗菌已經(jīng)開始大量繁殖失去可食用性。接種后的小米基質(zhì)培養(yǎng)12 h 后其硬度明顯變軟，證明納豆菌不止分泌蛋白酶，也會(huì)分泌淀粉酶來獲取外界多糖為自身生長(zhǎng)發(fā)育提供碳源。在發(fā)酵24 h 后其基質(zhì)會(huì)明顯發(fā)黏，在對(duì)納豆菌的研究中表明是由于聚谷氨酸的生成[36]，在小米的氨基酸組成中谷氨酸含量最為豐富[37]，其在發(fā)酵過程中作為聚谷氨酸合成的來源有利于聚谷氨酸快速生成，幫助基質(zhì)更好地保留水分，使細(xì)菌能更好地生長(zhǎng)發(fā)育。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用納豆中細(xì)來發(fā)酵小米具有良好的可行性。以基質(zhì)中蛋白含量與提取液DPPH自由基率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化和正交綜合平衡法分析，得出發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵時(shí)間24 h，接種量9%，發(fā)酵溫度37 ℃，基質(zhì)pH 值8，發(fā)酵后基質(zhì)蛋白含量3.84 mg/g，DPPH 自由基清除能力提高36%，ABTS 自由基清除能力提高38%。同時(shí)，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的其他產(chǎn)物，如多糖、聚谷氨酸，也為其相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)提供了新的視角。