HPLC-MS/MS 法測定動物源食品中7 種磺胺類藥物殘留

羅長琴，朱顯平 ，任 靜，譚春蓉，熊 雙

（1. 重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404100；2. 重慶安全職業(yè)技術(shù)學(xué)校，重慶 404100）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs） 是一類具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱，具有較強(qiáng)的抗菌作用[1-2]，是治療耳部、尿路、皮膚和軟組織感染的常見抗生素，因其價(jià)廉、抗菌譜廣，被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[3]，在保證動物性食品供應(yīng)充足方面發(fā)揮著巨大作用。但磺胺類抗生素的不合理使用和本身降解速度慢的特點(diǎn)，可通過動物源食品在人體內(nèi)蓄積，造成機(jī)體過敏、造血紊亂、泌尿系統(tǒng)損害、耐藥性增強(qiáng)等危害[4-6]。因此，為了保障動物用藥的安全性和有效性，以及動物源食品的食用安全[7]，許多國家均對食品中磺胺類藥物的最高殘留量做出了限量規(guī)定，如我國規(guī)定所有食用動物（肌肉、脂肪、肝、腎） 和魚類（皮和肉） 的最大殘留量（Maxi mum Residue Limits，MRL） 為100 μg/kg[8]。

目前，磺胺類殘留量的分析方法包括高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[9-10]、酶聯(lián)免疫分析法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[11]、超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）[12-14]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、高效毛細(xì)管電泳法（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）、氣相色譜質(zhì)譜法（Gas Chromatography Mass Spectrometry，GC/MS）、超臨界流體色譜法（Supercritical Fluid Chromatography，SFC） 和微生物法等[7]。其中，HPLC-MS/MS 法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析時(shí)間段短等優(yōu)勢，為最常用的磺胺類藥物分析方法。

磺胺類藥物殘留的前處理包括液液萃取[15-16]、固相萃取[17-18]、基質(zhì)固相分散萃取[19-20]等方法，這些方法都存在溶劑消耗量大、操作復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。Prime HLB 是一種新型固相萃取柱，采用“N -乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”作為反相復(fù)合填料，對樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等雜質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力，且無需活化與平衡，可直接上樣，操作極其簡便，過柱速度快，與傳統(tǒng)固相萃取方式相比較，凈化速度可提高40%[21]。采用Prime HLB 前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立測定動物源食品中7 種磺胺類藥物的測定方法。該方法簡便快速、易于操作，可為動物源食品中7 種磺胺類藥物殘留提供快速檢測方案。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020 年從重慶市超市、菜市場采購豬肉507 批次，畜副產(chǎn)品112 批次，魚肉762 批次，雞肉423 批次，共計(jì)1 804 批次。

1.2 主要試劑

乙腈（C2H3N）、甲醇（CH3OH），均為色譜純，德國默克股份公司提供；甲酸（HCOOH），色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司提供；乙酸銨（CH3COONH）4，優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；Prime HLB 固相萃取小柱，沃特世科技有限公司提供；7 種磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：磺胺甲基嘧啶（SMR：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度99.9%）、磺胺二甲基嘧啶（SM2：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度99.5%）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度97.9%）、磺胺地索辛（SDT：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度99.0%）、磺胺喹惡啉（SQX：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度97.2%）、磺胺氯噠嗪（SCP：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度99.5%）、磺胺嘧啶（SDZ：質(zhì)量濃度100 μg/mL，純度99.7%），北京曼哈格生物科技公司提供。

1.3 主要儀器

QUINTIX224-CN 型電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司產(chǎn)品；MILLI Q Advantage A10 型超純水機(jī)，美國MILLIPORE 公司產(chǎn)品；IKA MS3 Digital 型渦旋儀，德國艾卡公司產(chǎn)品；KQ-800DB DZ 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；3-30ks 型冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司產(chǎn)品；AB SCIEX QTRAP4500 型液相質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密吸取磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，再取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用10%甲醇水溶液配制成質(zhì)量濃度為10，20，40，80，100，150，200 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列，于4 ℃下保存，備用。

1.4.2 樣品前處理

將樣品解凍后，取具有代表的部分，攪碎，準(zhǔn)確稱取5.00 g 置于50 mL 離心管中，加入80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液5 mL，均質(zhì)30 s，超聲（100 W）提取5 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 冷凍離心3 min。上清液轉(zhuǎn)入另一支50 mL 離心管中，殘?jiān)偌尤? mL 80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液，均質(zhì)30 s，超聲（100 W） 提取10 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 冷凍離心3 min，合并上清液，混合均勻即為提取液。取3.0 mL 提取液過Prime HLB 固相萃取小柱，控制流速1 mL/min，收集接收液過0.22 μm 有機(jī)濾膜，即得上機(jī)待測液。

1.4.3 分析條件

液相條件：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18型色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.2 mL/min；流動相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸） （A） 和乙腈（B）。梯度洗脫程序：0~1.00 min，90% A；1.01~3.00 min，90%~10% A；3.01~7.00 min，10% A；7.01~8.00 min，10%~90% A；8.01~10.00 min，90% A 。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子（ES）I 源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 模式檢測，正離子掃描模式，電噴霧電壓5 500 V，霧化氣50 units，霧化器蒸發(fā)溫度500 ℃，反吹氣30 min，輔助加熱氣50 min。

磺胺類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 磺胺類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理

用賽默飛液質(zhì)自帶數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

在設(shè)定的條件下對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析。

7 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL） MRM 色譜圖見圖1。

圖1 7 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM 色譜圖

由圖1 可知，7 種磺胺類藥物分離效果較好，無明顯色譜雜質(zhì)峰干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

測定7 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度均為10，20，40，80，100，150，200 ng/mL），以峰面積（Y） 和對應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，ng/mL） 作線性方程。在10~200 ng/mL 內(nèi)，各磺胺類藥物的質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R在0.999 11~0.999 95，均在0.995 以上。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 方法檢出限和定量限

對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），10 倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ），對豬肉、豬肝、雞肉、魚肉4 種基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在多次重復(fù)測試下，將7 種磺胺類藥物的方法檢出限確定為2.5 μg/kg，定量限確定為9.0 μg/kg。

2.3.2 保留時(shí)間重復(fù)性

以40 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.4.3 儀器條件下進(jìn)行重復(fù)測定6 次。

7 種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間的重復(fù)性見表2。

表2 7 種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間的重復(fù)性

由表2 可知，各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間的精密度RSD 為0.06%~0.65%，表明出峰時(shí)間穩(wěn)定，作為目標(biāo)物定性分析結(jié)果可靠。

2.3.3 方法回收率及精密度

分別取豬肉、豬肝、雞肉、魚肉4 種空白基質(zhì)加入20，80，160 μg/kg 的低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按1.4.2 進(jìn)行前處理，1.4.3 的儀器方法進(jìn)行含量測定。

豬肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3，豬肝中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4，雞肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5，魚肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表6。

表3 豬肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表4 豬肝中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）/%

表5 雞肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）/%

表6 魚肉中7 種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）/%

結(jié)果表明，豬肉中7 種磺胺化合物3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為71.2%~104.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為0.9%~2.5%；豬肝的平均回收率為70.9%~102.4%，RSD 為0.3%~7.2%；雞肉的平均回收率為66.3%~103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為0.2%~4.4%；魚肉中7 種磺胺化合物3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為67.8%~98.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為0.8%~5.5%，這4 種基質(zhì)中的回收率和精密度結(jié)果均能達(dá)到國標(biāo)的要求[22]，可用于定量分析。

2.4 實(shí)際樣品的測定

2020 年從重慶市超市、菜市場采購豬肉507 批次，畜副產(chǎn)品112 批次，魚肉762 批次，雞肉423 批次，共計(jì)1 804 批次。其中，1 份豬肉檢出SMM（43 μg/kg），1 份魚肉檢出SDT（20 μg/kg）；豬腎檢出SDT（48 μg/kg），檢出率僅為0.17%，合格率高達(dá)100%。

3 結(jié)論

采用80%乙腈水（含0.2%甲酸） 溶液提取2 次后，經(jīng)過Prime HLB 凈化，以超高效液相色譜-四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法建立了動物源食品中7 種磺胺類藥物殘留的檢測方法。通過對豬肉、豬肝、雞肉、魚肉進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，結(jié)果7 種化合物保留時(shí)間相對穩(wěn)定；在線性范圍0.2~20.0 ng/mL 上具有良好的線性關(guān)系；檢出限為2.5 μg/kg，定量限為9.0 μg/kg，在低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為66.3%~104.3%，RSD 為0.2%~5.5%。該方法操作簡單、快速、靈敏度高，適用于動物源食品中7 種磺胺類藥物殘留的檢測。實(shí)際樣品的檢測，僅有1 份樣品檢出磺胺間甲氧嘧啶和2 份樣品檢出磺胺地索辛，檢出率為99.8%，且不存在超標(biāo)現(xiàn)象，表明近年來動物源食品的磺胺類抗生素殘留的監(jiān)管具有一定的效果。