熒光定量PCR 法檢測發酵果汁中嗜酸乳桿菌

王虹軍，陳芝娟，李曉靜

（1. 杭州博日科技股份有限公司，浙江杭州 310053；2. 鄭州糧食批發市場有限公司，河南鄭州 450000）

0 引言

嗜酸乳桿菌是重要的益生菌之一，也是人體胃腸道中的重要微生物。大數據顯示，益生菌被大量應用在食品中尤其是發酵乳制品中[1]。乳酸菌在發酵過程中能合成產生多種芳香物質和功能性成分，賦予發酵食品獨特的風味與營養，延長食品的貯藏時間[2-3]，還具有產生抑菌性代謝產物（有機酸、細菌素、過氧化氫等）、平衡腸道微生物生態系統、提高機體免疫力等諸多有利于機體的功能[4-5]。劉鑫等人[6]驗證嗜酸乳桿菌發酵上清液可治療多種腸道致病菌及其L 型菌感染引起的腸道疾病。嗜酸乳桿菌還能通過吸收同化膽固醇有效地降低膽固醇的含量[7]。Tajik H 等人[8]分析了與腐敗性細菌作用產生的有機致癌物質有關的細菌酶，經試驗驗證，嗜酸乳桿菌可以通過降低相關細菌酶的活性來降低它們向致癌物質轉變的可能。乳酸菌發酵果汁能在原果汁擁有的營養價值基礎上增添乳酸菌的有益功效，能夠滿足人們對健康和食品功能性的需求，加上果蔬產量的迅猛加增，乳酸菌發酵果蔬汁開始流行，發展前景十分廣闊[9]。

隨著發酵產品種類和數量的日益加增，發酵物料中乳酸菌的定量檢測已成為產品質量與功能評價的一項重要指標。目前，食品中乳酸菌檢驗方法有平板計數法（GB 4789.3—2016 規定）、流式細胞術、熒光定量PCR 法等，其中熒光定量PCR 技術因其擁有的高重復性、高靈敏度、無污染性等優點，在食品微生物檢測中得到了廣泛應用[10]。依據嗜酸乳桿菌基因保守區域序列設計出的引物及探針，運用實時熒光定量PCR 方法對果汁中嗜酸乳桿菌進行定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌，中國計量大學生命科技學院食品系提供；嗜酸乳桿菌發酵果汁；TaKaRa 基因組DNA純化試劑盒，用于提取并純化目標細菌的DNA。

MRS 培養基：胰蛋白胨10 g，七水合硫酸鎂0.58 g，檸檬酸氫二胺2 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.25 g，酵母浸粉5 g，吐溫- 80 1 mL，加蒸餾水至1 000 mL 調節pH 值至6.2~6.4，于立式壓力蒸汽滅菌器內121 ℃下滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D 單型人單面垂直凈化工作臺，蘇州智華凈化精密儀器有限公司產品；SHP-250 型生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司產品；Lambda 25 型紫外可見分光光度計，美國Perkin Elmer 公司產品；Kendro D-37520 型高速冷凍離心機，德國SorvallHeraeus 公司產品；GelX1650 型凝膠成像儀，上海歐翔科學儀器有限公司產品；QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument（96-well 0.2 mL Block） by Thermo Fisher Scientific。

1.3 試驗方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌含量與OD600線性關系

以嗜酸乳桿菌培養的最適條件，在液體MRS 培養基中連續活化2 次（菌種為保藏于-20 ℃的菌種），第2 次活化15 h 至其生長對數期。將這時的菌液稀釋為不同吸光度（OD600值分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0），相應吸光度的菌液再稀釋為適宜的3 個連續濃度，分別進行平板稀釋涂布，每個濃度3 個平行，置于培養箱培養36 h 后，選取有效的平板（菌落數在30~300 CFU/mL） 進行菌落計數。

1.3.2 模擬樣品及未知樣品核酸提取

（1） 模擬和未知樣品制備。將嗜酸乳桿菌活化后培養至109CFU/mL，以未發酵果汁為基質，進行梯度稀釋，分別為109，108，107，106，105，104，103CFU/mL，備用；將馴化成功的嗜酸乳桿菌按3%的量接入調好糖度、滅過菌的果汁中開始發酵，發酵完成后，取一部分進行平板稀釋涂布，計算菌落數，其余備用。

（2） 核酸提取。樣品混勻，將上述梯度稀釋液和發酵完成的果汁按基因組DNA 純化試劑盒所配說明進行核酸提取（若提取好的DNA 需較長時間存放則需用Elution Buffer 洗脫，置于-4 ℃或-20 ℃冰箱中，且不能反復凍融）。

1.3.3 核酸凝膠電泳檢測核酸

（1） 制膠。0.25 g 瓊脂糖+ 25 mL 1×TAE 微波爐加熱溶解，不燙手時倒膠。膠成型后，放入電泳槽內，往槽內加入緩沖液（槽內的緩沖液液面需蓋過膠面）。

（2） 進樣。15 000 DNA Marker 3 μL，DNA 提取物與溴酚藍染劑按4 μL+1 μL 體系混勻，用移液槍分別移至凝膠的樣孔中。

接通電泳儀和電泳槽開始跑樣，當溴酚藍的條帶至距膠板前沿約1 cm 處時，停止電泳，將凝膠從槽中取出放入凝膠成像儀的樣品室中，進行分析。

1.3.4 引物、探針設計

利用SPIDR 保守區域的序列設計特異性引物、探針，用于嗜酸乳桿菌的鑒定[11]。

1.3.5 熒光定量PCR 的擴增體系

Real-Time PCR 總反應體系是20 μL，包括Ta-KaRa 探測儀混合物10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L） 0.5 μL，DNA 模板2.0 μL，剩余部分以去離子水補齊。設置Real-Time PCR 反應要素為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，35 s，40 個循環。

1.3.6 模擬樣品檢測

將藥品按所需加入樣孔板中，其中的模板為梯度稀釋液中提取出的DNA，利用設置好反應條件的實時熒光定量PCR 儀對模擬樣品實施測定，所有濃度各設3 個平行。

1.3.7 未知樣品檢測

以在發酵果汁中提取出的DNA 為模板，將所需藥品按各自規定好的量加入樣孔板中，然后利用實時熒光定量PCR 儀以設置好的所有參數對未知樣品實施測定，樣品設置3 個平行。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌含量與OD600 值標準曲線

為了實現模擬樣品所需菌含量的準確培養，在進行模擬樣品制備之前，采用平板計數法將不同吸光度所對應的嗜酸乳桿菌的數量統計出來，并繪制成標準曲線。

嗜酸乳桿菌含量與OD600值的標準曲線見圖1。

由圖1 可知，曲線的相關系數為R2=0.992 8，所以嗜酸乳桿菌的含量與OD600值之間存在良好的線性關系，可用于后續試驗。

圖1 嗜酸乳桿菌含量與OD600 值的標準曲線

2.2 核酸電泳結果

將提取出的DNA 進行核酸凝膠電泳，檢測核酸的提取是否成功。

凝膠成像圖見圖2。

圖2 凝膠成像圖

由圖2 可知，8 樣泳道有明顯條帶，6，8 泳道處條帶微顯，其余樣品孔均無明顯條帶。已知條帶的熒光強度與DNA 含量成正比，因此分析原因為其余樣品的核酸含量比較低，所以未出現明顯條帶，但熒光定量PCR 法具有比常規PCR 法高得多的靈敏度，其絕對靈敏度可達到3 pg，所以提取出的核酸可用于后續試驗。

2.3 模擬樣品檢測及標準曲線建立

模擬樣品標準曲線見圖3。

圖3 模擬樣品標準曲線

在以未發酵蘋果汁為基質的模擬樣品的檢測中，以模擬樣品各梯度濃度所含菌落數的對數值（lg（CFU/mL）） 為橫坐標，以運行過程中Ct 值為縱坐標制作標準曲線。由圖3 看出，模擬樣品這兩條件之間有著較好的線性關系，這就證明這個試驗方法是行得通的。

2.4 未知樣品檢測結果

發酵蘋果汁的嗜酸乳桿菌中提取出的DNA 經設置好的實時熒光定量PCR 方法分析，檢測計算得出嗜酸乳桿菌的含量為2.27×108CFU/mL，最終定量結果與平板計數法所得結果（菌落數=2.32×108CFU/mL） 基本一致。由試驗數據可知采用實時熒光定量PCR 方法可以準確有效地定量蘋果汁中的嗜酸乳桿菌。

3 結論

用于熒光定量PCR 的DNA 模板有一定的純度要求，因此要選用適當的方法提取樣品中的DNA。果蔬基質中核酸提取的干擾因素相對較少，用試劑盒法（帶吸附柱） 提取比較合適[12]，上邊試驗中目標菌DNA 提取就選用的該法。

對于乳酸菌飲料中活菌的檢測，現行的國家標準采用的是平板計數法，該方法最大的缺點是樣品檢測周期長，難以滿足食品行業準確鑒定和快速檢測的發展需要。因此，運用基于PCR 的分子學方法尤其是RT-PCR 技術更具實際發展意義。Guo Z H 等人[13-14]通過實時熒光定量方法對發酵物中嗜酸乳桿菌進行定量定性。吳榮榮等人[15]選擇實時熒光定量PCR法對發酵乳中的德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌實施定量分析，最終數據顯示與平板計數得到的菌的數目基本一致。以上列出的研究都有效表明了實時熒光定量PCR法非常適合于乳酸菌發酵飲品的快速計數，且定量過程相對較快，還可以實現多個樣品的同時檢測和自動化[16]。其超高靈敏度和良好的重復性在姜鴻瑞等人[17-18]建立的熒光定量分子檢測方法中也被充分驗證。