基于網絡藥理學探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制

代澤陽

成都市龍泉驛區中醫醫院，四川 成都 610100

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)，該病的發生進展涉及多種危險因素，因此需聯合運用抗血小板、穩定斑塊、拮抗心肌重構、調節心肌能量代謝等藥物策略進行防治[1-2]。中醫學將冠心病歸屬于“胸痹心痛”范疇，本虛標實貫穿疾病的始終，本虛以氣虛、陰虛為主；標實以血瘀、痰濁、氣滯多見[3]。

中醫經典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍等組成，載于張仲景的《金匱要略》，《金匱要略·婦人雜病脈證并治》曰：“婦人宿有癥病，經斷未及三月……當下其癥，桂枝茯苓丸主之?！狈街泄鹬亟浲}，茯苓健脾祛痰，牡丹皮涼血活血，桃仁活血祛瘀，赤芍散瘀止痛。諸藥合用，共奏溫經、通絡、活血、化瘀、消癥之功，臨床多用于治療子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮內膜異位癥、盆腔炎、痛經、前列腺增生等疾病[4]。

基于中醫異病同治、治病求本理論，有文獻報道桂枝茯苓丸能改善心肌微循環，治療冠心病療效確切[5-7]。但桂枝茯苓丸治療冠心病的機制研究較少，本文運用網絡藥理學方法探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制，為后續深入研究提供參考和依據。

1 方法

1.1 收集桂枝茯苓丸有效成分及靶點基因通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com/index.php)收集桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍已知成分。在檢索結果中以口服利用度[8](oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性[9](drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出桂枝茯苓丸的有效成分。在TCMSP中對上述結果進行搜索匹配，得到有效成分的靶點蛋白，將靶點蛋白輸入Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數據庫，并將種屬選為“Homo sapiens”，檢索得到桂枝茯苓丸的標準靶點基因。

1.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點的篩選以關鍵詞“coronary heart disease”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數據庫中進行檢索，獲取冠心病相關靶點并加以整理。將桂枝茯苓丸靶點和冠心病靶點導入Draw Venny Diagram在線程序(http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集獲得藥物與疾病共同靶點，此集合為桂枝茯苓丸治療冠心病的潛在靶點。

1.3 藥物-成分-靶點網絡圖繪制將桂枝茯苓丸有效成分、潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-成分-靶點網絡圖。其中節點(node)代表藥物、有效成分、潛在靶點；邊(edge)連接藥物、有效成分與靶點，展現相互作用關系。

1.4 核心網絡分析運用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet、CytoNCA插件對潛在靶點構建蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)網絡分析、拓撲分析，構建核心網絡，經篩選得到核心靶點，以分析桂枝茯苓丸有效成分治療冠心病的作用靶點。

1.5 GO功能和KEGG富集分析將核心靶點導入Hiplot在線作圖工具(https：//hiplot.com.cn/advance/clusterprofiler-go-kegg)，以P<0.05為條件進行GO功能、KEGG通路富集分析，其中GO功能分析包括生物進程(biological process，BP)、細胞組分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)。用氣泡圖形式展示分析結果，以探究桂枝茯苓丸治療冠心病可能的作用機制。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸的有效成分、靶點基因收集和整理在TCMSP中檢索桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍的有效成分，根據OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，去重后得到包含作用靶點的有效成分43個，見表1。將有效成分對應靶點蛋白通過Uniprot數據庫轉換為人類基因名，經去重后共獲得210個標準靶點基因。

2.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點篩選在GeneCards數據庫中檢索關鍵詞“coronary heart diseases”，共得到7 100個相關基因。使用Draw Venny Diagram在線程序將冠心病相關且關聯分數≥19.71共889個基因，與桂枝茯苓丸210個靶點基因取交集，最終獲得89個潛在靶點，見圖1。

2.3 藥物-成分-靶點網絡構建使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制桂枝茯苓丸治療冠心病“藥物-成分-靶點”網絡圖，其中包含284條邊、126個節點，見圖2。度值越大，節點形狀越大、作用越關鍵，該圖直觀反映了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點治療冠心病。本研究結果發現，43個有效成分通過89個靶點對冠心病起到直接調控作用，其中25個成分單獨或共同作用于PTGS2、PTGS1、PRKACA、NR3C2、ESR1、CASP3、BCL2、ADRB2、PDE3A、CN5A、PPARG等靶點。圖2中度值排名靠前的活性成分依次為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素，這些認為是桂枝茯苓丸治療冠心病的核心成分。由此可見，中藥治療疾病具有多成分、多靶點的特點。

表1 桂枝茯苓丸43個有效成分收集結果

圖1 桂枝茯苓丸-冠心病韋恩圖

注：黃色圓形表示藥物；藍色六邊形表示成分；綠色菱形表示潛在靶點；邊表示它們之間的相互作用圖2 桂枝茯苓丸治療冠心病的“藥物-成分-靶點”網絡

2.4 PPI網絡分析、核心靶點篩選以潛在靶點為基礎利用Cytoscape中Bisogenet插件構建PPI網絡；采用CytoNCA插件進行拓撲分析和核心網絡構建，一級子網絡篩選條件：Degree≥29，二級子網絡(核心網絡)篩選條件：Degree≥221、局部平均連通度(local average connectivity,LAC)≥26.469、Betweenness≥12 319.327、Closeness Centrality≥0.463，共獲得70個核心靶點基因，見圖3。依照Degree值由大到小排序，展示排名前10位的靶點，見表2。

圖3 桂枝茯苓丸治療冠心病的PPI 網絡核心靶點篩選示意圖

表2 排名前10位的核心靶點

2.5 GO功能和KEGG富集分析將70個核心靶點基因導入Hiplot在線作圖工具，以P<0.05進行GO功能、KEGG通路富集分析。選取GO功能分析中前10條通路繪制氣泡圖，見圖4。結果顯示：BP主要涉及細胞代謝、生長、分化、凋亡等；MF主要涉及泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、轉錄共調節因子激活、鈣黏蛋白結合、組蛋白脫乙?；附Y合、蛋白磷酸酶結合、受損DNA結合、無序域特異性結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、MHCⅡ蛋白復合物結合；CC主要涉及黏著斑、細胞基質結合、囊腔等。

選取KEGG通路富集分析中前20條通路，見圖4，發現核心基因主要富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內質網中的蛋白質加工等信號通路。

圖4 桂枝茯苓丸治療冠心病的GO功能和KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

本研究篩選出桂枝茯苓丸共43個有效成分，210個藥物靶基因與889個疾病靶基因相映射，得到包括功能酶、信號分子、轉錄因子等89個潛在靶點。由此可見，桂枝茯苓丸主要通過調控89個潛在靶點干預機體多種生物進程、多條信號通路來治療冠心病，并抑制其進展為急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)。對冠心病有調控作用的主要有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素等。研究顯示，槲皮素通過影響血管細胞增殖、抑制炎癥反應途徑拮抗動脈粥樣硬化[10]，也能減輕心肌缺血再灌注損傷。β-谷甾醇具有調節血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等作用[11]。山柰酚具有抗氧化應激活性，可降低血管炎癥反應、防止動脈粥樣硬化發生、抑制心肌細胞凋亡[12]。兒茶素能抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CRP、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥介質、下調核轉錄因子(nuclear factor kappa beta,NF-κB)表達，對冠心病模型大鼠有保護作用[13]。黃芩素對發生缺血、缺氧損傷的心肌具有保護作用[14]。

通過KEGG通路富集分析發現，核心基因主要顯著富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內質網中的蛋白質加工等信號通路。以PI3K-Akt信號通路最為重要，該通路被激活，關鍵蛋白Akt將從細胞膜轉移到細胞質和細胞核，通過磷酸化抑制或增強靶蛋白活性，進而調節下游信號通路，參與調節細胞代謝、增殖、存活及血管生成等。例如，冠心病患者重要危險因素和治療目標是血脂中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平[15]。血管內皮下的LDL能被修飾成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL可抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路中Akt和eNOS磷酸化，導致血管內皮損傷、血小板聚集、單核細胞浸潤、泡沫細胞形成，構成動脈粥樣硬化斑塊的脂質核心、促進動脈粥樣硬化斑塊形成[16]。而Akt能激活eNOS促進一氧化氮生成，產生抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抑制血小板活性、擴張冠狀動脈等生物學效應[17]；Akt能激活mTOR抑制細胞自噬進程，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，誘導巨噬細胞自噬，減少巨噬細胞對斑塊的浸潤，穩定動脈粥樣硬化易損斑塊[18]，預防ACS發生。Akt還能夠磷酸化IKK調節NF-κB信號轉導、抑制促凋亡蛋白Bad調控細胞存活、抑制CDK影響細胞增殖。PI3K-Akt信號通路也是FoxO轉錄因子的主要上游通路，FoxO轉錄的基因能夠調控細胞周期、誘導細胞凋亡、抵抗氧化應激、促進DNA修復等[19]。研究表明，FoxO信號通路參與拮抗心肌纖維化、減輕心臟缺血再灌注損傷[20]。此外，泛素介導的蛋白水解通路能抗氧化、抗炎、降解細胞周期相關蛋白質、抑制血管內膜增生、誘導血管平滑肌細胞凋亡、防止動脈粥樣硬化進展[21]。Notch信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡，能通過拮抗心肌纖維化、抑制炎性反應抗動脈粥樣硬化，還能抑制平滑肌細胞過度增殖、穩定粥樣硬化斑塊[22]。癌癥中的microRNA通路關聯動脈粥樣硬化病理過程[23]。甲狀腺激素信號通路涉及拮抗心肌重構、調節促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化過程[24]。內質網中的蛋白質加工通路調控內質網應激，干預動脈粥樣硬化的發生、發展，調控血管內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞活性、凋亡[25]。因此，桂枝茯苓丸通過介導細胞增殖凋亡、細胞分解、氧化應激、炎癥反應等治療冠心病、防止其進展為ACS。

冠心病是由環境、基因共同作用的復雜疾病，需要采取多種措施進行防治。桂枝茯苓丸能由拮抗動脈粥樣硬化、穩定粥樣硬化斑塊、改善心肌缺血缺氧、抑制心肌纖維化等方面治療冠心病、防止其進展為ACS，這與冠心病病理生理過程和中醫異病同治、治病求本思想相符。綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法論證了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點、多通路治療冠心病，為桂枝茯苓丸治療冠心病進一步研究奠定基礎，也為擴展中醫經典方劑臨床運用提供參考。由于檢索數據庫有限、分析不全面等主客觀因素的存在，使該研究存在一定局限性，仍需進行深入研究。