二醇型人參皂苷HPLC含量測定研究

林花王欣宇金龍哲刁春研安然武文琳車成來

(1.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省汪清縣農業技術推廣中心,吉林 汪清 133100)

人參(Panax ginseng G.A.Meyer)為五加科植物，味甘，微苦，性平和，是我國具有代表性的傳統中藥，有多年的中醫臨床應用歷史，具有強大的治愈作用[1]。經研究表明，人參皂苷是人參主要的活性成分，其種類和含量是評價人參及其產品質量的重要指標。按照人參皂苷苷元的差別，將人參皂苷分成齊墩果酸型皂苷、原人參三醇型皂苷和原人參二醇型皂苷。二醇型人參皂苷含有多種人參皂苷，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg、Re等，是人參的主要活性成分，具有抗腫瘤[2]、增強免疫[3]、調節神經系統[4]、改善心腦血管功能[5]、保護肝臟[6]、延緩衰[7]等功效。本研究采用高效液相色譜法測定人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd，為人參的質量控制提供可靠的依據。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀(1260,安捷倫)，十萬分之一電子天平(OHAUS)，超聲波清洗機(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)，獨立超純水系統(OminiG，廈門銳思捷水純化技術有限公司)，冷凍干燥機(Benchtop Pro 3L ES-55,SP Scientific),離心機(TG16-WS,湖南湘立科學儀器有限公司)，pH計(STARTER 2100，奧豪斯上海化學有限公司)。

1.2 試驗試藥

人參皂苷標準品Rb1、Rb2、Rc、Rd(成都德銳可生物科技有限公司)，氫氧化鈣(天津市科密歐化學試劑有限公司，20160618)，甲醇(沈陽化學試劑場)，磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，20141009)，乙腈(沈陽化學試劑場)，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。人參(長白山紅參)。

2 試驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

分別稱取對照品Rb1、Rb2、Rc、Rd各2mg,分別加入甲醇2mL，得到1mg·mL-1的單標品溶液，用于人參皂苷的定性分析，確定各個單體的出峰時間。另分別稱取人參皂苷對照品Rb1 2.16mg,Rb2 2.30mg,Rc 2.28mg,Rd 2.10mg,再分別加入2mL甲醇，制備成濃度為1.08mg·mL-1、1.15mg·mL-1、1.14mg·mL-1與1.05mg·mL-1的儲備液，分別從4份儲備液中提取0.25mL，混勻，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

將人參切成1cm3的小塊，再用刀片式粉碎機粉碎成粗粉，過40目篩，即得人參粗粉。蒸餾水用飽和石灰水調節成pH13的堿水，精密稱取人參粉末5g，加入50mL堿水，攪拌均勻，利用超聲清洗機在溫度20℃，功率180W的條件下堿水超聲提取30min，取出燒杯，將提取液用離心機進行離心5min轉速為10000r·min-1，得到濾液進行冷凍干燥3d，取出干燥物，磨成粉末，得到粉末1.12g，取粉末500mg，加入50mL甲醇，超聲溶解，即得10mg·mL-1的供試品溶液。

2.2 含量測定方法

2.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱Hypersil Gold C18 (250mm×4.6μm,5μm),檢測波長為203nm，進樣量為10μL，柱溫為40℃，流速為1.000mL·mL-1，梯度洗脫如表1所示。

表1 梯度洗脫

2.2.2 標準曲線的制備

取4種單標溶液，分別用移液槍吸取1mL放入4個進樣小瓶，在2.2.1色譜條件下進行高效液相檢測分析，每種皂苷都會出現其特征峰，記錄出峰時間，用于人參皂苷的定性分析，可用來確定4種人參皂苷混合時的出峰順序。另分別從Rb1、Rc、Rb2、Rd 4種儲備液中各吸取100μL放入同一進樣小瓶，各皂苷濃度均為0.25mg·mL-1。分別從4種儲備液中吸取90μL，放入同一進樣小瓶，再加入甲醇40μL配制成總體積為400μL，濃度為0.225mg·mL-1的混合對照品溶液。分別從4種儲備液中吸取80μL放入同一進樣小瓶，再加入甲醇80μL，配制成總體積為400μL，濃度為0.2mg·mL-1的混合對照品溶液。按此方法，配制出濃度梯度為0.175mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.125mg·mL-1和0.1mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.025mg·mL-1的10組混合對照品溶液。將10個濃度梯度的進樣小瓶用于高效液相檢測，按照已經確定的出峰順序來判斷各個時間所出的峰為哪種人參皂苷，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

2.2.3 精密度試驗

取2.1.1中制備的混合對照品溶液，在2.2.1的色譜條件下進行HPLC檢測分析，每次進樣10μL，連續進樣5次，利用得到的混合標準品溶液中各個皂苷單體的峰面積計算RSD值。若RSD值均不大于2%，則儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗

精密吸取4種人參皂苷混合的供試品溶液，在0h、2h、4h、8h、12h分別進樣10μL，在2.2.1的色譜條件下進行HPLC檢測分析，根據所得到的混合樣品中各個皂苷單體的峰面積，計算RSD值。如果RSD值不大于2%，則說明供試品溶液穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗

精密吸取4種人參皂苷混合的供試品溶液，平均分為5份，在2.2.1的色譜條件下進行HPLC檢測分析，平行5次試驗，根據所得到的混合樣品中各個皂苷單體的峰面積，計算RSD值。如果RSD值小于3%，則表明重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗

取已被準確定量的混合對照品溶液：濃度分別為Rb1 0.102mg·mL-1、Rb2 0.128mg·mL-1、Rc 0.128mg·mL-1、Rd 0.111mg·mL-1，從中吸取1mL作為空白樣品溶液。另取濃度為0.1mg·mL-1的單標溶液，分別將每種單標溶液取0.1mL放進空白溶液中。在2.2.1的色譜條件下進行HPIC檢測分析，平行5次試驗，根據所得到的各個皂苷單體的峰面積，利用標準曲線的線性回歸方程計算各個皂苷單體的濃度，從而計算各個單體的加樣回收率。

2.3 樣品測定

將供試品溶液經0.45μm微孔濾膜抽濾后，精密吸取1mL，在2.2.1的色譜條件下，連續進樣3次，每次進樣會得到4種單體的峰面積，根據標準曲線回歸方程，會計算出每種單體的濃度，繼而可以計算出每種單體的含量，3次進樣后每種單體會有3個含量，取平均值。

3 試驗結果

3.1 人參皂苷的定性分析

取單標準品溶液，根據2.2.1的色譜條件進行4種人參皂苷標準品Rb1、Rb2、Rc、Rd的定性分析，確定其出峰時間，如圖1～4所示。

圖1 人參皂苷標準品Rb1色譜圖

圖2 人參皂苷標準品Rc色譜圖

圖3 人參皂苷標準品Rb2色譜圖

圖4 人參皂苷標準品Rd色譜圖

結果顯示，人參皂苷標準品Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰時間分別為16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min。

在2.2.1的液相色譜條件下，將4種人參皂苷標準品的混合標準品溶液進行HPLC檢測分析，檢測分析結果如圖5所示。

圖5 混合人參皂苷標準品Rb1,Rc,Rb2,Rd色譜圖

根據結果顯示，上述4種人參皂苷標準品的混合樣品中，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰時間范圍分別在16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min的范圍內，因此，混合標準品與各人參皂苷標準品單品所檢測到的出峰時間具有良好的對應關系。從而確定該液相色譜條件能夠很好地分離出4種人參皂苷。

3.2 人參皂苷的定量分析

3.2.1 標準曲線的制作

取按照濃度梯度稀釋的混合對照品溶液，根據上述的色譜條件進行高效液相檢測，根據已經得知的出峰時間和出峰順序記錄各個人參皂苷單體的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作的標準曲線如圖6～9所示。

圖6 人參皂苷Rb1的標準曲線

圖7 人參皂苷Rc的標準曲線

圖8 人參皂苷Rb2的標準曲線

以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得到線性回歸方程，Rb1：Y=3E+07X+140948，相關系數R2=0.9995；Rc：Y=3E+07X-165794,相關系數R2=0.9995；Rb2：Y=2E+07X+55853,相關系數R2=0.9995；Rd：Y=3E+07X-155679,相關系數R2=0.9998。根據結果得知4種人參皂苷有良好的線性關系。

3.2.2 精密度試驗

通過2.2.3的試驗方法，所得到的峰面積如表2所示。

圖9 人參皂苷Rd的標準曲線

表2 精密度

由表2可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是0.54%、Rc是0.86%、Rb2是0.98%、Rd是1.10%，均不大于2%，因此表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩定性試驗

通過2.2.4的試驗方法，所測得的峰面積如表3所示。

表3 穩定性

由表3可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是1.2%、Rc是1.5%、Rb2是1.3%、Rd是1.7%，RSD值均不大于2%，因此說明4種人參皂苷的穩定性良好。

3.2.4 重復性試驗

通過2.2.5的試驗方法，檢測所得到的峰面積如表4所示。

表4 重復性

由表4可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是2.5%、Rc是2.4%、Rb2是2.5%、Rd是2.4%，RSD值均不大于3%，因此表明供試品溶液的重復性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗

通過2.2.6的試驗方法，進行測定，計算加樣回收率，所得結果如表5所示。

表5 加樣回收率

如表5可知，加樣回收率均在95%～105%，RSD值均不大于2%，表明加樣回收率符合標準。

3.3 樣品測定

取供試品溶液進行測定，所得結果如表6所示。

表6 樣品測定

由表6可知，所測得含量為Rb1是0.522%、Rc是0.679%、Rb2是0.864%、Rd是0.177%。

4 結論

本文通過高效液相色譜法測定4種人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量。此法準確、有效、經濟、簡便，并且具有良好的重復性和穩定性，確定了測定的條件方法，驗證了方法的準確性與可靠性，為人參皂苷的分離提純奠定了基礎。