廣東清遠H9亞型禽流感的分離及初步鑒定

岑明珠 張輝華

(佛山科學技術學院，廣東 佛山 528200)

前言

禽流感(Avian Influenza，AI)，又稱真性雞瘟、歐洲雞瘟[1,2]，是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一種禽類的急性、熱性、敗血性、高度接觸性傳染病。根據該毒株在禽類中的毒力和臨床表現，可分為高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus，LPAIV)[3]，其主要誘發全身性疾病和較高的發病率和死亡率[4]，家禽類動物感染后的臨床癥狀為上呼吸道疾病、生殖系統疾病和生長發育受阻等，嚴重的導致全身性出血、敗血癥[5]，受感染的動物有哺乳類動物、家禽類、野生禽類(水禽)、觀賞鳥等[6,7]。

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)會引起禽類大批量發病死亡，也可引起豬、馬、貂、海豹和人類感染死亡，世界動物衛生組織(OIE)將其列為A類傳染病，高致病禽流感被我國列為一類重大動物疫病。H9亞型禽流感病毒多為低致病性毒株，主要引起產蛋下降或呼吸道癥狀。流感不僅對畜牧業經濟的發展造成影響，而且嚴重危害人類健康，還可能引起社會動蕩不安，影響社會穩定。為了更好地防控流感，為了人類的健康、畜牧的經濟發展不受到影響，應該建立長期控制禽流感傳播的措施[8,9]。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料采集自廣東省清遠地區養殖場，病料具體背景信息如表1所示。

表1 病料的背景信息

1.2 雞胚

無特定病原體(SPF)雞胚購于廣東大華農動物保健品股份有限公司。

1.3 使用試劑

RNA提取試劑盒，上海飛捷生物技術有限公司；Prime Script反轉錄試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；RT-PER一步法試劑盒，鼎國生物科技有限公司；瓊脂糖，上海普飛生物技術有限公司；DNA Marker，生物工程(大連)有限公司；禽流感H9亞型血凝抑制陽性血清，哈爾濱維科生物技術有限開發公司；V型96孔反應板；1%雞血紅細胞，人獸共患病防控制劑國家地方聯合工程實驗室專業人員制備。

1.4 主要儀器

高轉速離心機、普通PCR儀、-80℃超低溫冰箱、生物安全柜，美國Thermo公司；恒溫培養箱、電子恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本Tomy公；凝膠電泳裝置、凝膠成像分析儀，北京榮陽經典科技有限公司；微量振蕩器，常州奧華儀器有限公司。

1.4.1 病料的采集

將病死雞剖解，觀察并記錄病變部位及情況，將氣管、肝臟、肺臟等組織取出放入采集袋中。

1.4.2 病料的保存

將采集到的病料用剪刀剪碎后加入適量無菌pH 7.0～7.4的PBS(等滲磷酸鹽緩沖液)內(含10000單位的青、鏈霉素)快速研磨，磨好后分裝到1.5mL無菌離心管中，每管約1mL，處理后的病料全部放于-80℃冰箱中，30min后從冰箱中取出并放置于室內室溫解凍，按上述步驟反復凍融3次后，將已凍融處理的樣品10000r·min-1離心5min，吸取經離心過樣品中的病料上清液并加入至新的1.5mL無菌EP管中，隨后將病料上清液于-80℃冰箱中存放。

1.4.3 病毒的增殖及收獲

從-80℃冰箱中取出病料上清液解凍，每種病料以0.2mL/枚接種到3枚10日齡的SPF雞胚的尿囊腔中，并將接種過病料上清液的SPF雞胚在37℃恒溫培養箱中存放，培養96h，利用照蛋器觀察雞胚情況，早晚2次，在4℃冰箱中把96h后培養的雞胚放入過夜，第2天在無菌工作臺收集尿囊液；將收集的尿囊液再次接種雞胚，96h后再次收集，按上述方法連續盲傳2代后，把最后無菌收集到的雞胚尿囊液作為種毒，于-80℃冰箱中存放。

1.4.4 流感病毒(A型)特異性測定

將分離到的病毒接種雞胚尿囊腔中，雞胚尿囊腔中的尿囊液具備血凝活性，使用具有血凝活性的雞胚絨毛尿囊膜制備成抗原，再使用標準H9陽性血清進行HI(血凝抑制)試驗來檢測受檢樣品中是否含有禽流感病毒。

1.4.5 抗原制備

在具備血凝活性的雞胚尿囊腔中取出尿囊液，按0.1%濃度的量加入福爾馬林溶液。置于35～37℃保溫箱中滅活36h后做病毒液滅活檢驗，檢驗合格后可作為HI實驗抗原。用標準H9陽性血清進行型特異性測定，分離的病毒與標準的陽性血清之間出現清晰的紅細胞沉淀線，可判定從樣品中分離的病毒含有A型禽流感病毒。

1.5 血凝(HA)試驗與血凝抑制(HI)試驗

1.5.1 材料準備

V型96孔微量反應板，PBS，1%雞紅細胞懸液，移液器(含有配套槍頭)，H9亞型禽流感標準分型陽性血清以及陰性血清。

1.5.2 血凝(HA)試驗

在96孔反應板內均加入PBS 25μL，換槍頭；吸25μL感染性雞胚尿囊液加入第1孔混勻；從第1孔吸取25μL病毒懸液加入第2孔，吹打混勻吸25μL加入第3孔，以此類推倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸25μL棄掉，換槍頭；每孔再加入25μL PBS；每孔均加入25μL 1%雞紅細胞懸液；震蕩混勻，在室溫(20～25℃)下靜置30min后觀察結果。

1.5.3 血凝抑制(HI)試驗

根據血凝試驗結果配置4 HUA抗原。取完全凝集的病毒最高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即是含有4HUA的抗原稀釋倍數。

在V型微量反應板中均加入PBS 25μL，換槍頭；吸25μL標準陽性血清加入第1孔混勻，從第1孔吸25μL標準陽性血清加入第2孔，吹打混勻吸25μL加入第3孔，以此類推倍比稀釋至第11孔，從11孔吸25μL，棄掉，換槍頭；1～11孔均加入25μL 4HUA抗原，室溫靜置40min；每孔均加入25μL 1%雞紅細胞懸液；震蕩混勻，在室溫靜置30min后觀察結果。

1.6 引物的設計與合成

上游引物H9-ID序列：CTAATTGCTCCATGGTAT；下游引物H9-ID序列：CCAACCTCCCTCTATGA；引物合成為廣州艾基生物科技有限公司。

1.6.1 病毒的RNA提取

依照病毒RNA提取試劑盒對雞胚尿囊液中的病毒基因組進行抽提，將抽提成功RNA樣品用來做病毒基因組反轉錄和PCR擴增，其余的放置-80℃冰箱進行儲存。

依照鼎國科技有限公司的RT-PER說明書進行實驗，在生物安全柜中配置50μL的PCR體系，具體包括25μL的2×1Step mix，2.5μL的Enzyme mix，2μL的上游引物，2μL的下游引物，13.5μL的RNase free H2O，5μL的下模板RNA。將混勻的上述液體，放入離心機中離心30s，在將離心后的液體放入PCR儀中進行PCR擴增，該體系的反應程序如表2所示。

表2 PCR擴增反應體系

1.6.2 瓊脂糖凝膠電泳

1.6.2.1 電泳點樣

吸20μLPCR擴增產物和對應的陰陽性對照加入各對應孔中，設定標準分子量Maker做分子質量大小對照(電泳條件：電壓150V，電泳時間30min)。

1.6.2.2 結果判定

電泳結束后，關閉電源，將凝膠取出，放置凝膠成像系統，UV紫外燈觀察核酸條帶，判定結果。

2 結果

2.1 血凝(HA)結果

血凝(HA)試驗在室溫(20～25℃)下靜置30min后，結果如圖1所示。

圖1 HA試驗結果

2.2 血凝(HI)結果

血凝抑制(HI)在室溫(20～25℃)下靜置30min后，結果如圖2所示。

圖2 HI試驗結果

2.3 RT-PCR結果

2.3.1 病料RT-PCR結果

對待檢病料進行RT-PCR以及AGE(Agarose Gel Electrophoresis)，觀察放入成像系統的AGE后的凝膠，可見清晰、明顯DNA條帶。通過DNA Marker與樣品bp對比，特異性DNA條帶bp數約730，與預期的M基因大小相符合，電泳結果見圖3。

2.3.2 尿囊液RT-PCR結果

從雞胚中增殖獲得的分離株尿囊液進行RT-PCR擴增，以及擴增產物糖凝膠電泳，電泳后的凝膠在凝膠成像系統中進行觀察，在成像系統中可見清晰的DNA條帶。DNA條帶與DNA Marker對比可知，擴增條帶大小為750bp，電泳結果見圖4。

圖3 H9分離毒株基因的RT-PCR檢測結果

圖4 H9尿囊液基因的RT-PCR檢測結果

2.4 序列分析結果

將該H9亞型禽流感分離株進行基因測序，用生物分子學軟件在NCBI與比較，分析結果確定分離株為H9亞型禽流感病毒。

3 結果與討論

據報道，世界各地的家禽都有禽流感，禽流感對人類和家禽的健康影響是巨大的[10]，除了家禽行業遭受經濟的損失外，禽流感的爆發還極有可能是致命的，導致人類的肺部感染[10]。了解禽流感病毒在環境中的分布和特征非常重要[11]，其在我國呈多發、地方性流行、持續存在，抗原漂移、基因重組現象十分普遍，形成了遺傳分支，我國H9亞型禽流感病毒隨時間而進化，均屬于歐亞群系，主要位于CK/BJ/1/94-Like分支上，且近些年分離的病毒同源性較高。

H9亞型禽流感除會引起呼吸道消化道癥狀、出血性病變外，還會嚴重引起蛋雞產蛋量、生殖道或隱性感染，病程長短不定，大量雞群死亡造成不可逆轉的經濟損失。目前國內使用H5N1亞型疫苗對禽類進行強制性免疫，免疫密度高達100%，能有效防止高致病性禽流感(H5亞型)疫情發生，但只用高致病性禽流感(H5N1亞型)疫苗對家禽進行免疫，并不能防止低致病性禽流感的發生和流行，并且由于H9N2亞型禽流感的低致病性特點，通常被忽視，造成低致病性禽流感呈流行性和養禽業生產持續性損失。H9N2持續呈多樣化，形成多種抗原的不同譜系，許多指標表明,H9N2病毒可能會進一步促進具有大流行潛力的毒株出現[12]。

低致病性禽流感病毒預防措施，堅持自繁自養，禁止混養不同種動物，做好殺蟲滅鼠工作；做到源頭撲殺，切斷傳播途徑，加強疫苗的研發，從分子生物學角度來了解低致病性禽流感病毒的變異情況，為防止低致病性禽流感的流行提供有效的理論依據。此次試驗對廣東清遠分離到的H9亞型禽流感毒株，進行測序及序列分析，對于研發疫苗等工作需要更深入的研究。