鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法討論

楊美琴 蔡春燕 劉鵬 劉枕 馬仕洪 胡昌勤

(1 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2 淄博市食品藥品檢驗研究院，淄博 255086)

鹽酸莫西沙星屬于第四代喹諾酮類抗菌藥物，通過干擾細菌的拓撲異構酶Ⅱ和Ⅳ影響細菌的繁殖代謝，有廣譜殺菌作用[1]。目前，鹽酸莫西沙星片在國內已經廣泛應用于上呼吸道感染、尿路感染、前列腺感染等臨床治療，效果良好[2-7]。

2014年，鹽酸莫西沙星片在國內首次獲批進口；2018年國內研制的鹽酸莫西沙星片也獲批上市；截至2021年，國內已有10個企業的鹽酸莫西沙星片獲批上市。監管緊跟臨床需求[8]，作為成熟的上市藥品，鹽酸莫西沙星片微生物限度符合中國藥典的規定是對其最基本的質量要求。但由于本品對革蘭陽性菌、陰性菌，以及厭氧菌、抗酸菌、非典型病原菌都具有較好的抗菌作用，在微生物限度檢查時，較強的抑菌活性大大影響了方法的重現性、合理性。目前僅部分國產鹽酸莫西沙星片的質量標準中明確收載了微生物限度檢查方法。隨著喹諾酮類產品升級換代，此類抗菌藥物的微生物限度檢查難度會不斷增加，因此關于喹諾酮類抗生素、包括鹽酸莫西沙星的微生物限度檢查方法討論一直都是相關領域關注和討論的技術難點[9-17]。

本文基于2021年鹽酸莫西沙星片國家評價性抽驗結果，在匯總不同藥品質量標準中收載的微生物限度檢查方法的基礎上，參考文獻研究結果，討論該品種方法操作中可能存在的問題，并針對日常檢驗給出相對粗放、簡便的檢查方法，提高該品種的檢驗效率。本文的結果對其他喹諾酮類口服制劑微生物限度檢驗控制工作亦有所啟示。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高壓滅菌器，Yamato-SQ510C/SQ810C；電子天平，Sartorius-CPA2202S-DS；生物安全柜，Thermo-12854FT；恒溫培養箱，Yamato-INC821C；薄膜過濾系統，Millipore-MILLIFLEX PLUS/EZSTREAM1。

1.2 試藥與耗材

pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發公司，20210125)，0.9%無菌氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司，2001033205)，胰酪大豆胨瓊脂培養基(對照培養基，135025-201803)，胰酪大豆胨液體培養基(Merck，F0BB21915)，沙氏葡萄糖瓊脂培養基(上海諾狄生物科技有限公司，4333201224-14N)，六水合氯化鎂(Merck， A0725033837)，無水硫酸鎂(天津市大港億中化工廠，20050405)，羥丙基-β-環糊精(HPCD，北京華威銳科化工有限公司，HW20B1201-6)，聚山梨酯80(吐溫80，國藥化學試劑有限公司，20190919)，無菌濾杯(默克化工技術，

EFHAW10MS，F0JB82610C)。

1.3 菌種

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]；金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]；枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]；白念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉 (Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]來自中國食品藥品檢定研究院，中國醫學細菌保藏中心。

2 試驗方法

2.1 方法比較

匯總各標準中微生物限度檢查方法的異同，包括：供試液制備用稀釋劑類型，需氧菌總數(TAMC)和大腸埃希菌檢查用供試液濃度、沖洗液及中和劑使用情況，霉菌和酵母菌總數(TYMC)的檢查條件。

2.2 鎂離子中和劑適用性討論

2.2.1 鎂離子與溶液的相容性

根據《中國藥典》2020年版四部通則配方，制備6種無菌溶液：0.9%氯化鈉溶液(NS)、pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(PB)、pH6.8/7.2/7.6磷酸鹽緩沖液(PBS6.8/7.2/7.6)和0.1%蛋白胨水溶液(PW)。按照表1要求，在3個溫度條件下，觀察不同濃度的鎂離子在各溶液中是否產生沉淀，判斷其相容性。

2.2.2 鎂離子對微生物生長的影響

采用TSA培養基，以表面涂布接種的方式，比較中國藥典規定的6株測試菌株在2種濃度氯化鎂條件下的回收率(表2)。回收率在80%～130%時，認為相應濃度的鎂離子則對測試菌株生長無影響。氯化鎂溶液添加量不超過培養基體積的10%。

表2 TSA-鎂離子對微生物生長的影響條件Tab.2 The condition of different TSA-magnesium affects the growth of test organisms

2.3 稀釋劑/沖洗液對微生物生長的影響

在標準比較、文獻調研的基礎上，制備無菌1%HPCD-1%吐溫80-0.1 mol/L氯化鎂水溶液(HTMg)，測試該沖洗液滅菌后pH。在10 mL/支HTMg溶液中，分別接種表2列舉6種測試菌株1000 cfu/0.1 mL，分別在1 h、2 h進行“HTMg-菌液”注皿計數，計算兩個時間相對于0 h的回收率，回收率在80%～130%則認為沖洗液對測試菌株生長無影響。

2.4 優化的鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法及適用性討論

以HTMg pH(7.0±0.2)溶液分別制備4個企業鹽酸莫西沙星片的1:10，1:100供試液。取1:100供試液上清，按1 mL/膜至100 mL HTMg pH(7.0±0.2)中，全量過濾后，以HTMg pH(7.0±0.2)沖洗3次(100mL/次)；將濾膜貼于TSA平板(含0.1 mol/L 氯化鎂)檢查需氧菌總數。取1:10供試液，按1 mL/皿，依法檢查霉菌和酵母菌總數；取1:10供試液上清液10 mL分膜過濾，按5 mL/膜至100 mL HTMg pH(7.0±0.2)中，全量過濾后，以HTMg pH(7.0±0.2)沖洗3次(100 mL/次)；取2膜至100 mL的TSB(0.1 mol/L氯化鎂)中，依法檢查大腸埃希菌。

制備5批次TSA培養基，其中Ab-A、Ab-Y為國外培養基，In-N為國產預制培養基；Ab-A-Mg、Ab-Y-Mg為含0.1 mol/L 氯化鎂的TSA平板。

TAMC和大腸埃希菌檢查在最后一次沖洗液添加約100 cfu測試菌株，計算回收率；TYMC，在供試液中添加測試菌株，計算回收率；回收率應滿足藥典要求。

3 結果

3.1 方法分析匯總

對各企業鹽酸莫西沙星片質量標準中微生物限度檢查方法的匯總結果見表3～4。可見，由于莫西沙星對細菌具有非常強的抗菌活性，其對需氧菌總數(TAMC)、大腸埃希菌檢查需要綜合使用稀釋劑、中和劑、薄膜過濾等多種方式，才能滿足方法適用性的要求。

表3 需氧菌總數(TAMC)檢查方法匯總列表Tab.3 Summary of TAMC examination methods from different manufactures

在對TAMC的檢查中，稀釋劑、檢測量、薄膜過濾沖洗、TSA培養基是影響試驗的關鍵因素：(1)稀釋劑：通過在供試液稀釋劑中添加離子/非離子中和劑(吐溫80、卵磷脂、HPCD、Mg2+)可抑制莫西沙星的活性，實現第一步預處理；(2)檢測量：檢測量大部分在0.01 g(1:100供試液1 mL/膜)，較低的檢測量可降低沖洗難度，但當檢測量為0.001 g時，無論標準為1000 cfu/g或是2000 cfu/g，檢驗結果均存在較大的誤判風險[18]；(3)薄膜沖洗過程：主要通過調整吐溫80、卵磷脂、Mg2+和沖洗量4個因素去除活性成分，沖洗量一般控制在400～1000 mL/膜；(4)TSA培養基：在培養基中添加Mg2+是進一步抑制殘留于薄膜上的莫西沙星活性的關鍵。

大腸埃希菌的檢查條件與TAMC基本相同，但由于檢測量大(相當于1 g樣品)，大多采用分膜的方式降低單膜過濾沖洗難度，總沖洗量一般控制在600～3200 mL不等(表4)。鑒于喹諾酮類藥物對真菌的抑制作用較弱，霉菌和酵母菌總數(TYMC)檢測的實際檢測量都在0.05～0.1 g，多采用直接接種法檢查(表4)。

表4 大腸埃希菌、霉菌和酵母菌總數(TYMC)檢查方法匯總列表Tab.4 Summary of Escherichia coli , TYMC examination methods from different manufactures

通過表3～4匯總可見，各標準中的檢查方法在使用時各有其特點，總體而言，對中和劑的使用尚有描述不甚明確的地方，如鎂離子(0.2%，12 g/L)的濃度，1:10供試液10 mL薄膜過濾的可操作性，鎂離子中和劑的添加方式，鎂離子液體在濾膜的作用時間控制等。

3.2 鎂離子中和劑的適用性考察

3.2.1 鎂離子與溶液的相容性

本部分討論的6種溶液可以分為兩類：不含磷酸鹽的NS與0.1%蛋白胨水溶液(PW)，含磷酸鹽的PB與3種PBS。含有磷酸鹽的4種溶液，在“2.2.1鎂離子與溶液的相容性”試驗中，經121℃、15 min滅菌，不同的鎂離子濃度條件下均產生沉淀；不含磷酸鹽的2種溶液在此條件下無沉淀；說明鎂離子與磷酸鹽體系在滅菌過程中會產生沉淀。

在57℃條件下，NS、PW和PBS6.8未見沉淀，PB、PBS7.2、PBS7.6在0.05 mol/L及以上濃度都有沉淀產生(表5)。但室溫條件下，各溶液均未產生肉眼可見沉淀。

表5 57℃條件下3種溶液與鎂離子相容性結果Tab.5 The results of compatibility between magnesium and solution at 57℃

上述結果提示，鎂在堿性和磷酸鹽系統中，加熱易發生沉淀。這也是表3中，鎂離子大多要求在使用時添加的原因。

3.2.2 鎂離子對微生物生長的影響

鎂離子對微生物生長的影響不僅與鎂離子濃度有關，也與鎂離子存在時TSA對微生物的促生長能力有關。由表6可見，大部分條件下“TSA-鎂離子”培養條件對測試菌株的生長沒有影響，但當鎂離子在培養基中大的濃度等于或高于0.2 mol/L時，枯草芽胞桿菌的生長受抑制；當鎂離子濃度達0.3 mol/L時，大腸埃希菌回收率為0。文獻[9]在無菌檢查工作中，也證實0.1 mol/L鎂離子具有較好的中和效果且對微生物生長無影響。

表6 TSA-鎂離子對微生物生長的影響Tab.6 The basic attribute of magnesium reagent

3.3 稀釋劑/沖洗液對微生物生長的影響

溶解性更好、沖洗效率更高的稀釋劑/沖洗液是提高薄膜過濾法效率的重要因素。為了更好地滿足實際操作及固化程序，經測試，pH未經調試的1%HPCD-1%吐溫80～0.1 mol/L氯化鎂水溶液(HTMg)，121℃，15 min滅菌后pH約為5.2。此時，雖然HTMg呈偏酸性，但6株測試菌株2 h內回收率穩定，提示HTMg可作為稀釋劑/沖洗液使用，詳見表7。為更好的滿足實際操作并固化操作程序，可適當調整該稀釋劑/沖洗液pH用于檢驗工作。

表7 稀釋劑/沖洗液適用性檢查結果(%)Tab.7 The suitability results of diluent/flushing fluid(%)

3.4 優化的鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法適用性結果

4個企業的產品按照“2.4”中優化的鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法進行檢驗，TAMC、TYMC計數方法條件下，白念珠菌和黑曲霉回收率均在80%～130%范圍；大腸埃希菌檢查的陽性對照則生長良好。

TAMC檢驗時，測試細菌的回收情況隨產品處方的差異、培養基差異而表現出略有不同(表8)：①含有鎂離子的TSA對測試菌株的回收更優，提示鎂離子對于濾膜殘留的活性組分有顯著的中和效果。②不含鎂離子的3種TSA培養基，雖然均可滿足培養基適用性的要求，但當殘留有莫西沙星時，生長情況不盡相同；總體而言，金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌兩個測試菌株可以更敏感地反映檢驗系統對莫西沙星的去除效率。③相同的沖洗系統對不同企業產品的沖洗效率差異較大，提示制劑處方的差異對檢測方法具有一定的影響。

表8 各企業鹽酸莫西沙星片TAMC檢查測試細菌回收率結果(%)Tab.8 The test strain recovery of TAMC method used for moxifloxacin hydrochloride tablet of different manufactures(%)

TAMC和大腸埃希菌檢驗用的供試液為不均一的混懸溶液，供試液的顆粒物影響薄膜過濾的效率。因此，薄膜過濾時候可將供試液稍靜置，取上清液檢測。這也是表3中部分方法要求使用上清液的原因。通常供試液靜置0.5 min就能達到較好分離顆粒的效果。

綜上所述，本優化方法的沖洗量為400 mL/膜，采用含鎂離子(0.1 mol/L)TSA檢查TAMC；大腸埃希菌檢查的沖洗量為800 mL/2膜，接種于含鎂離子(0.1 mol/L)TSB中。稀釋劑與沖洗液一致，便于標準化制備，較表3～4中的大部分方法更為簡便。本優化方法適用4個企業的鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查，方法具有良好的粗放性。

4 討論

4.1 中和劑

4.1.1 鎂離子

雖然鎂離子可顯著提高檢查方法的沖洗效率[19]，但本文結果提示，鎂離子與沖洗液、培養基都存在相容性問題，在使用環節有諸多需要注意的事項。相對準確的鎂離子濃度直接影響方法的重現性。

無水硫酸鎂常用作干燥劑，無水氯化鎂也有較強的引濕性。由表9可見，含鎂試劑水合物分子量大約是無水物的2倍，若簡單以質量分數表示鎂離子的實際含量，常易導致鎂離子濃度出現偏差。由于結晶水的差異，且水合物的溶質體積較大，因此不建議使用百分質量濃度的方式標示實際的用量。應用時，建議采用容量瓶準確配制特定濃度的濃溶液，使用時按比例稀配至培養基或沖洗液中，以保證離子濃度的準確。鎂離子濃溶液添加至培養基時，為保證培養基體系的穩定性，建議添加量不超過培養基體積的10%。

表9 含鎂試劑基本屬性Tab.9 The basic attribute of magnesium reagent

4.1.2 吐溫80、卵磷脂和羥丙基β環糊精

喹諾酮類抗生素分子基本骨架均為氮(雜)雙并環結構，水溶性差，成鹽后可提高其生物利用度[20]。表3～4以及“2.4”的方法都是以水為基質的體系，部分藥品標準收載的方法中采用了吐溫80(聚山梨酯80)、卵磷脂、羥丙基β環糊精(HPCD)提高抑菌活性組分在稀釋劑/沖洗液中的溶解性，提高沖洗效率去除抑菌成分。

吐溫80為非離子表面活性劑，卵磷脂為兩性離子表面活性劑，羥丙基β環糊精(HPCD)作為包合材料[21-23]在藥物制劑增溶、穩定等方面有廣泛的應用。

但吐溫80和卵磷脂在水系統中，需要注意乳化效果以保證溶液均一。例如，吐溫80在稀釋劑/沖洗液中滅菌后容易沉底，需要搖勻；卵磷脂若未經充分乳化立即滅菌，則易結塊，難以保證其增溶效果。

4.2 離子濃度、濾膜及培養基

“2.2.1鎂離子與溶液的相容性”中的5種溶液均含有無機鹽離子，其中pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液和0.9%氯化鈉溶液中鈉離子的濃度大概0.15 mol/L ；3種PBS均含鈉、鉀離子，兩種陽離子總濃度在PBS6.8中約0.001 mol/L ，在PBS7.2中約0.06 mol/L ，在PBS7.6中約0.05 mol/L 。據此，結合“2.2.2鎂離子對微生物生長的影響”的結果，確定優化方法中稀釋劑/沖洗液僅含氯化鎂一種無機鹽，適當以氫氧化鈉調pH，陽離子總體濃度約為0.1 mol/L 。

不同供應商的濾器、濾杯可能采用不同尺寸、不同材質的過濾薄膜(醋酸纖維素膜/尼龍膜/聚偏二氟乙烯膜等)，在進行測試菌株的回收檢查時，可能會影響方法重現。本文采用的濾膜是混合纖維素膜(直徑47 mm)，未對其他薄膜材質進行驗證。表6和表8中涉及的TSA培養基均滿足培養基適用性檢查的要求，但當培養基系統出現選擇性因素(高濃度鎂離子、殘留的抑菌活性組分)，也會造成上述測試菌株的回收失敗。因此，當采用不同的濾器及培養基時，應考慮方法的重復性。

4.3 對產品污染微生物的控制

對藥品生產的全過程控制包括原輔料前端控制、生產環境潔凈控制、生產設備清潔驗證、人員衛生防護、生產過程取樣檢測等環節。目前，微生物污染已經不是化學藥品口服固體制劑終產品的主要質量問題。本次抽驗涉及上述4個企業共28批樣品，微生物限度檢查結果全部符合《中國藥典》的規定。

《中國藥典》2020年版四部通則9202中已明確對諸如鹽酸莫西沙星片等化學口服固體制劑，通過風險評估、回顧性驗證，可不進行批批放行檢驗。針對本品，若執行不定期檢驗，應有完整合理的質量保障體系保證每批產品均符合微生物限度的規定，應有重現性好、易操作的檢測方法保證檢測結果的有效性。

由本文結果可見，本品不同標準中收載的微生物限度檢查方法還存在不甚明確的地方，可能導致實際執行中檢查方法不可重現的情況。對此，建議各企業質控部門完善各自SOP，例如TAMC檢查時，隨行以金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌作為陽性對照菌確認檢驗條件的有效性等。

本文優化的鹽酸莫西沙星片的微生物限度檢查方法，適用于4個企業的產品，在一定程度上反映了方法本身良好的粗放性、便捷性。但通過本文的討論，更希望質控人員能結合各自具體的產品，制訂各自更具有執行性的SOP，提高自有方法的可執行性及穩定性。