HPLC法測定乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的依地酸二鈉

陳希 鄢雷娜 段和祥 章紅 劉緒平

(江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029)

左氧氟沙星為第三代喹諾酮類抗生素，易與金屬離子形成絡合物而失去活性[1]，特別是Fe3+離子與乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中左氧氟沙星絡合后，注射液的顏色可以變成深棕色[2]。注射液生產中會使用大量不銹鋼的生產設備，加大了Fe3+離子引入的概率，所以部分生產企業在處方中加入依地酸二鈉(EDTA-2Na)以掩蔽金屬離子，依地酸二鈉與金屬離子形成的絡合物穩定性強于左氧氟沙星，能避免左氧氟沙星失去活性及注射液顏色變深[3-4]。

目前依地酸二鈉測定方法主要有如下幾種：分光光度法[5-6]、離子色譜法[7-9]、GC-MS法[10-11]、LC-MS法[12-13]和HPLC法[14-16]。分光光度法需要復雜的前處理，且靈敏度和專屬性較色譜法差；GC-MS法雖然靈敏度和專屬性較好，但需要酯化衍生后才能進行GC分析，且酯化衍生時間(2h)較長；離子色譜法也具有較高的靈敏度，但乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中有大量的乳酸根離子和氯離子干擾，同時樣品中左氧氟沙星的存在也會色譜柱造成較大的損傷，如果采用離子色譜法分析至少要采用銀柱和C18柱凈化。依地酸二鈉易與樣品和流動相中金屬離子絡合，且依地酸二鈉和相關金屬絡合物均具有較大極性，采用HPLC法直接進樣分析依地酸二鈉出峰時間很快且峰型較差；所以一般采用金屬離子絡合依地酸二鈉轉化成單一穩定絡合物，并在流動相中加入離子對試劑延遲出峰時間。國內外的文獻報道的HPLC法測定依地酸二鈉很多都在流動相中離子對試劑，而LC-MS無法采用離子對試劑導致出峰時間很快，其次LC-MS分析也需要進行金屬離子衍生化及凈化處理等步驟，前處理繁瑣。依地酸二鈉與常見金屬離子的穩定常數的對數值(lgKMY)Fe3+為24.23、Cu2+為18.7、Ca2+為10.69，說明Fe3+穩定性最高，生成的絡合物EDTA-Fe3+最穩定[17]。綜合考慮本研究選擇離子對試劑-液相色譜法以氯化鐵作為衍生劑測定乳酸左氧氟沙星氯化鈉中依地酸二鈉。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)，MS205DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 材料和試劑

乙二胺四乙酸二鈉基準試劑 (上海山浦化工有限公司，批號：2020年4月12日，含量按100%計算)，三氯化鐵為分析純，水為純化水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液：回音必集團江西東亞制藥有限公司樣品15批次， E公司樣品2批次，浙江莎普愛思藥業股份有限公司樣品(未添加依地酸二鈉)1批次。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相：50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(含5 mmol/L的四丁基溴化銨，用磷酸溶液調節pH值至4.5)-乙腈(90:10，V/V)；流速：1.0 mL/min；色譜柱為InertSustain AQ-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫40℃；進樣量10 μL；檢測波長：257 nm。

2.2 溶液配制

稱取氯化鐵約0.54 g，加水200 mL溶解并搖勻，作為鐵離子衍生化試劑(含Fe3+約為0.01 mol/L)。

精密稱取乙二胺四乙酸二鈉基準試劑50.30 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為依地酸二鈉標準品儲備溶液(約1000 μg/mL)。精密量取依地酸二鈉標準品儲備溶液2 mL，加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，作為標準品溶液(相當于依地酸二鈉約200 μg/mL)。

精密量取未添加依地酸二鈉的乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液樣品5 mL和依地酸二鈉標準品儲備溶液2 mL，加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，作為陽性對照溶液。

精密量取乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液樣品5 mL，加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法優化

2.3.1 離子對試劑濃度的選擇

EDTA-Fe3+極性較大，流動相如不加離子對試劑在C18色譜柱中幾乎沒有保留。EDTA-Fe3+為酸性化合物，添加陽離子對試劑可以延長其保留時間。

參照上述色譜條件保持乙腈比例、磷酸鹽濃度和pH不變，考察四丁基溴化銨濃度變化對標準品溶液EDTA-Fe3+峰測定的影響，結果見表1。四丁基溴化銨濃度增大，標準品溶液中EDTA-Fe3+峰保留時間有明顯延長，且理論板數也有較大提升。四丁基溴化銨濃度為5 mmol/L能較好的延長EDTA-Fe3+保留時間到5 min，且整個分析時間小于10 min。色譜圖詳見圖1。

表1 流動相四丁基溴化銨濃度對EDTA-Fe3+峰的影響Tab.1 Influence of the concentration of mobile phase tetrabutylammonium bromide on the peak of EDTA-Fe3+

2.3.2 磷酸緩沖鹽pH的選擇

調節流動相中磷酸二氫鈉溶液至不同的pH值，按本文色譜條件分析，結果見表2。結果表明相同pH值時，陽性對照溶液和標準品溶液中EDTA-Fe3+峰保留時間近似；pH值越大EDTA-Fe3+峰保留時間越晚，但pH值越大陽性對照溶液中EDTA-Fe3+峰的理論板數、拖尾因子和峰高都變差。其次pH值越大，左氧氟沙星峰保留時間也相對延長了，pH值6.0時左氧氟沙星峰保留時間約20 min，pH值4.5時左氧氟沙星峰保留時間約7 min。因此，綜合考慮將磷酸緩沖鹽pH優選為4.5。

表2 磷酸緩沖鹽pH對EDTA-Fe3+峰的影響Tab.2 The influence of phosphate buffer salt pH on EDTA-Fe3+peak

2.3.3 磷酸鹽濃度的選擇

參照上述色譜條件保持乙腈比例、流動相中四丁基溴化銨濃度和pH不變，考察磷酸二氫鈉濃度變化對測定的影響，結果見表3。磷酸二氫鈉濃度越大，EDTA-Fe3+峰保留時間越短；而磷酸二氫鈉濃度較小時，供試樣品和陽性對照溶液中EDTA-Fe3+峰保留時間有稍許偏差，且左氧氟沙星峰與EDTA-Fe3+峰有一定重疊，對測定有干擾。因此，最終優選磷酸二氫鈉濃度為50 mmol/L。

表3 流動相磷酸二氫鈉濃度對EDTA-Fe3+峰的影響Tab.3 Influence of mobile phase sodium dihydrogen phosphate concentration on EDTA-Fe3+ peak

2.3.4 乙腈比例和柱溫的選擇

保持水相條件不變，考察乙腈比例和柱溫變化對測定的影響，結果見表4。結果表明溫度對保留時間影響較小，乙腈比例影響較大。乙腈為5%時，EDTA-Fe3+峰保留時間延遲了近2 min，但左氧氟沙星峰保留時間延長到約24 min，約為10%乙腈分析時左氧氟沙星峰保留時間的3倍。因此，綜合考慮選擇乙腈體積比例為10%，柱溫選擇40℃。

表4 流動相乙腈比例對EDTA-Fe3+峰和左氧氟沙星峰的影響Tab.4 The effect of mobile phase acetonitrile ratio on EDTAFe3+ peak and levofloxacin peak

2.3.5 衍生化條件的選擇

精密量取依地酸二鈉標準品儲備溶液2 mL，分別加衍生化試劑0.25～2 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻， 按上述色譜條件分析，結果見表5。衍生化試劑加0.5 mL時EDTA-Fe3+峰面積已為1 mL的96%，而1和1.5 mL時EDTA-Fe3+峰面積基本無變化。說明依溶液中依地酸二鈉質量即使達到2000 μg，衍生化試劑添加1 mL也已足夠，因此，優選衍生化試劑體積為1 mL。

表5 衍生化試劑體積對EDTA-Fe3+峰和左氧氟沙星峰的影響Tab.5 The influence of derivatization reagent volume on EDTA-Fe3+ peak and levofloxacin peak

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性

精密量取依地酸二鈉標準品儲備溶液1mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為依地酸二鈉標準品儲備溶液二(約20 μg/mL)。分別取依地酸二鈉標準品儲備溶液2、1.5、1和0.5 mL和依地酸二鈉標準品儲備溶液二5、2和1 mL置10 mL量瓶中，各加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，制成依地酸二鈉標準曲線系列溶液(相當于含依地酸二鈉濃度約為200、150、100、50、10、4和2 μg/mL)。

按上述色譜條件，取依地酸二鈉標準曲線系列溶液10 μL分別進樣并記錄色譜圖。以EDTA-Fe3+峰面積為縱坐標(y)，以依地酸二鈉濃度(x)為橫坐標進行線性回歸。依地酸二鈉濃度在2～200 μg/mL之間與EDTA-Fe3+峰面積呈良好線性關系，回歸方程為：y=1.417×104x+9.71×102，R2=0.9999。

2.4.2 精密度

精密量取依地酸二鈉標準品儲備溶液1mL，置10 mL量瓶，加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，按上述色譜條連續進樣6次(10 μL)，記錄色譜圖。計算EDTA-Fe3+峰面積(1427924、1432473、1432811、1432186、1432774、1431269)的RSD為0.35%，說明本方法精密度良好。

2.4.3 重復性

取回音必集團江西東亞制藥有限公司樣品(批號：2019101913，規格：100 mL:左氧氟沙星0.2 g和氯化鈉0.9 g)按上述溶液配制方法制備6份供試樣品溶液，按上述色譜條件進行分析，并記錄色譜圖。計算6份樣品中EDTA-Fe3+峰面積(657226、660738、664585、661920、654754、661488)的RSD為0.54%，說明本方法重復性良好。

2.4.4 穩定性

精密量取依地酸二鈉標準品儲備溶液1 mL，置10 mL量瓶，加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，分別在0、2、4、6、8、10和12 h時按上述色譜條件測定，計算各時間時EDTA-Fe3+峰面積(1414008、1426801、1426861、1427951、1427742、1427092、1426761)的RSD為0.4%。說明EDTA-Fe3+在12 h內穩定。

2.4.5 定量限與檢出限

取依地酸二鈉標準品儲備溶液二適量，分別置10 mL量瓶，各加衍生化試劑1 mL，再加水稀釋至10 mL，搖勻，制成相當于含依地酸二鈉約為0.4和1.2 μg/mL的溶液，分別按上述色譜條件進行測定，結果顯示依地酸二鈉濃度為0.4 μg/mL時，EDTA-Fe3+峰信噪比均大于3，依地酸二鈉濃度為1.2 μg/mL時EDTA-Fe3+峰信噪比均大于10。當待測樣品取樣量為5 mL，稀釋體積為10 mL時，本方法的檢出限和定量限可以定為0.8和2.4 μg/mL。

2.4.6 準確度

取浙江莎普愛思藥業股份有限公司(批號：190917-2A1，規格：250 mL，左氧氟沙星0.5 g，處方中未使用依地酸二鈉)5 mL，置10 mL量瓶中(9份)，分別加依地酸二鈉標準品儲備溶液1.5、1.0和0.5 mL(每個濃度3份)，各加衍生化試劑1 mL，再分別加水稀釋至刻度，搖勻，分別按上述色譜條件測定，計算回收樣中的依地酸二鈉濃度和回收率，結果詳見表6。回收率為100.26%～101.02%，平均為100.7%，RSD為0.28%，說明本方法準確度良好。

表6 回收率結果表Tab.6 Recovery rate result table

2.5 樣品測定

按“2.2 溶液配制”和“2.1 色譜條件”制備供試樣品溶液并測定，結果E公司處方中未添加依地酸二鈉，但有2批次樣品檢出依地酸二鈉，濃度分別為16.5和17.9 μg/mL。浙江莎普愛思藥業股份有限公司樣品未檢出依地酸二鈉。回音必集團江西東亞制藥有限公司處方中依地酸二鈉添加量為100 μg/mL，15批樣品均檢出依地酸二鈉，平均值為96.3 μg/mL。

3 討論

本研究建立了HPLC法測定乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中依地酸二鈉的方法，根據依地酸二鈉與Fe3+離子能生成穩定EDTA-Fe3+絡合物的性質，采用氯化鐵對樣品中依地酸二鈉進行衍生化。再利用EDTA-Fe3+為酸性化合物的性質，使用陽離子對試劑四丁基溴化銨延長EDTA-Fe3+峰保留時間。研究考察了離子對試劑濃度、磷酸鹽濃度、水相pH、有機相比例以及衍生化試劑用量等對測定的影響。得到了最佳流動相組成：50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(含5 mmol/L的四丁基溴化銨，用磷酸溶液調節pH值至4.5)-乙腈(90:10，V/V)。本方法前處理簡單快速，分析時間短，且具有較好的準確度、靈敏度和精密度，適用于乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射用中依地酸二鈉的質量控制。