色譜柱參數(shù)對(duì)鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)HPLC分析的影響研究

楊妹妹 黃鵬 李瑋,*

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230012；2 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，合肥 230051)

四環(huán)素(TC)廣泛應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性和陰性菌、支原體以及立克次體等引起的感染[1-2]。四環(huán)素類藥物對(duì)各種氧化劑、酸和堿都不穩(wěn)定，其在生產(chǎn)、貯存以及進(jìn)入環(huán)境后會(huì)發(fā)生降解并產(chǎn)生代謝和降解產(chǎn)物，影響藥物的純度[3-5]。TC在堿性溶液中，會(huì)降解生成異四環(huán)素而失去抑菌活性；在強(qiáng)酸(pH≤2.0)溶液中生成脫水四環(huán)素，再而生成其差向異構(gòu)體脫水差向四環(huán)素；而長(zhǎng)時(shí)間置于弱酸(pH2.0～6.0)，會(huì)產(chǎn)生4-差向四環(huán)素，生物活性降低；金霉素是在使用金霉菌生物合成四環(huán)素時(shí)，由于氯離子的存在而產(chǎn)生[6]；土霉素來(lái)源于原料藥發(fā)酵環(huán)節(jié)[7]，以上均是2020版《中國(guó)藥典》中四環(huán)素所考察的有關(guān)物質(zhì)。

目前中國(guó)藥典鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)測(cè)定采用HPLC法，使用十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18柱)為填充劑、醋酸銨和乙腈作為流動(dòng)相[8]。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，4-差向四環(huán)素和土霉素分離度(R12)、金霉素的理論塔板數(shù)(R5N)較難達(dá)到要求，是鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)分析條件優(yōu)化過(guò)程中的關(guān)鍵目標(biāo)因子，并且采用不同的C18柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果差異很大。R12如果太小，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)將無(wú)法通過(guò)；R5N如果過(guò)低，將大大降低方法的靈敏度。在本課題組先前的報(bào)道中[9]，詳細(xì)探討了流動(dòng)相對(duì)上述色譜分析中關(guān)鍵目標(biāo)因子的影響，但尚未見(jiàn)色譜柱參數(shù)對(duì)四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)分析影響的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用Snyder等基于疏水消除模型提出的色譜柱參數(shù)表征不同色譜柱的差異[10]，研究不同的色譜柱對(duì)鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)分析的影響，探討柱參數(shù)與關(guān)鍵色譜參數(shù)R12和R5N的關(guān)系，便于藥物分析工作者在實(shí)際工作中有目的地選擇出合適的色譜柱。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

LC-20A液相色譜儀(島津公司)；SevenExcellence型pH計(jì)、電子天平XP205(梅特勒-托利多公司)；鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)130488-201604)、4-差向四環(huán)素對(duì)照品(批號(hào)130401-201911)、土霉素對(duì)照品(批號(hào)130487-200703)、脫水差向四環(huán)素對(duì)照品(批號(hào)130403-201205)、鹽酸金霉素對(duì)照品(批號(hào)130489-201403)、脫水四環(huán)素對(duì)照品(批號(hào)130402-200203)、鹽酸四環(huán)素原料，均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；四環(huán)素片(桂林南藥股份有限公司)；乙腈(賽默飛世爾科技有限公司)；三乙胺(Aladdin)；醋酸銨、乙二胺四醋酸二鈉和鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)適用性溶液的制備

稱取鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品約48 mg與土霉素對(duì)照品、4-差向四環(huán)素對(duì)照品、脫水差向四環(huán)素對(duì)照品、鹽酸金霉素對(duì)照品及脫水四環(huán)素對(duì)照品各約3 mg，置于100 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL完全溶解，再加水稀釋至刻度，搖勻[8]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)色譜條件與色譜柱參數(shù)

按《中國(guó)藥典》2020版中鹽酸四環(huán)素的色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫：40℃；流速1.0 mL/min，流動(dòng)相為醋酸銨溶液[0.15 mol/L醋酸銨溶液-0.01 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100:10:1,V/V/V)，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至8.5]-乙腈(83:17,V/V)[8]。所有色譜柱均在此條件下進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)色譜柱信息見(jiàn)表1，其中1號(hào)～12號(hào)色譜柱用于建立模型，13和14號(hào)色譜柱用于驗(yàn)證。

表1 實(shí)驗(yàn)色譜柱信息Tab.1 Column information

2 理論與計(jì)算

2.1 分離因子α與色譜柱參數(shù)的關(guān)系式

Snyder/Dolan方法是Snyder等在溶劑化方程的基礎(chǔ)上提出的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)方程[11-14]：

其中，η'，σ'，β'，α'和κ'為溶質(zhì)參數(shù)；H，S，A，B和C等是色譜柱參數(shù)；k和kref分別是在測(cè)試條件下溶質(zhì)和參比溶質(zhì)(乙苯)的保留因子[15]。由于乙苯在本實(shí)驗(yàn)條件下極難出峰，因此我們選擇四環(huán)素作為參比溶質(zhì)，計(jì)算四環(huán)素與不同雜質(zhì)的Logα值。

依據(jù)方程(1)，一對(duì)難分離雜質(zhì)對(duì)，選擇不同的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，可得到如下關(guān)系方程[16]：

方程(2)顯示，難分離雜質(zhì)對(duì)的Logα值(Logα12)僅與色譜柱參數(shù)有關(guān)，溶質(zhì)參數(shù)的差值Δη'，Δσ'等為常數(shù)。對(duì)于任何物質(zhì)對(duì)，只需要建立方程(2)，就可以根據(jù)色譜柱已有的柱參數(shù)，推算出該物質(zhì)對(duì)在任何一個(gè)色譜柱中的分離情況。

2.2 相似度計(jì)算用于選擇色譜柱

采用相似度(Fs)表征不同色譜柱的差異。公式(1)中的色譜柱參數(shù)C與流動(dòng)相的pH有關(guān)，可通過(guò)柱參數(shù)C(2.8)和C(7.0)用插值法計(jì)算[17]。下式可用于計(jì)算不同色譜柱的相似度[14,18]：

當(dāng)分離對(duì)象不變時(shí)，方程(3)中的權(quán)重因子fch，fcs，fca，fcb和fcc可用方程(2)中相對(duì)應(yīng)溶質(zhì)參數(shù)差值的絕對(duì)值如|Δη'|，|Δσ'|等除以0.004表示[19]。參照文獻(xiàn)[19]定義RT值來(lái)描述雜質(zhì)對(duì)的分離度：當(dāng)雜質(zhì)對(duì)分離度大于2.5，則RT為1；當(dāng)雜質(zhì)對(duì)的分離度小于2.5，RT為分離度與2.5的比值，RT越接近1則雜質(zhì)分離越完全。

2.3 R5N與柱參數(shù)關(guān)系式

色譜柱參數(shù)與理論塔板數(shù)之間的相關(guān)模型尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文在考察柱參數(shù)與R5N之間的函數(shù)關(guān)系時(shí)，嘗試采用不同的線性回歸和非線性回歸方程，得到方程式(4)：

式中各參數(shù)的意義同上，d為常數(shù)項(xiàng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸剔除不顯著項(xiàng)，方程(4)可較為合理地表征R5N與柱參數(shù)的關(guān)系。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱參數(shù)對(duì)分離度的影響

3.1.1 4-差向四環(huán)素和土霉素分離因子(α12)與柱參數(shù)的關(guān)系

采用不同色譜柱進(jìn)行鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)分析的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖(圖1)。可見(jiàn)，4-差向四環(huán)素和土霉素為較難分離物質(zhì)對(duì)。圖2顯示了各個(gè)雜質(zhì)在不同色譜柱上的分離情況。將1～12號(hào)色譜柱參數(shù)與α12進(jìn)行線性回歸(表2)，可得方程

表2 R12、α12與R5NTab.2 R12, α12 and R5N

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(表3)，R=0.912，P＜0.05，回歸方程顯著，可以選擇其Δη'，Δσ'等用于后續(xù)的計(jì)算。

表3 雜質(zhì)對(duì)1/2的溶質(zhì)參數(shù)與統(tǒng)計(jì)參數(shù)Tab.3 Solute and statistical parameters of impurity pair 1/2

3.1.2 影響R12的關(guān)鍵色譜柱參數(shù)

利用方程(5)計(jì)算色譜柱的相似度，由公式(3)可以得出

在計(jì)算色譜柱之間的相似度時(shí)，選擇1號(hào)色譜柱為參考柱，其R12=3.26，繪制RT和Fs的散點(diǎn)圖。如圖3(A)所示，F(xiàn)s在0到4.3之間，有10個(gè)色譜柱的RT均不小于0.8，滿足分離的要求。

根據(jù)方程(6)，在表4中列出了各項(xiàng)參數(shù)的均值與標(biāo)準(zhǔn)差，可以看出，[fcc(C2-C1)]2的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差均為最大值，即為權(quán)重的最大一項(xiàng)，提示C參數(shù)是影響R12的最重要因素。根據(jù)方程(6)繪制Fs對(duì)C的散點(diǎn)圖(圖4)，可以看出數(shù)據(jù)Fs值隨著C值增大而增大，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Fs=3.807C+1.3858，R2=0.8647。

表4 方程(6)中各參數(shù)權(quán)重Tab.4 The weight of each parameter in equation (6)

依據(jù)Fs-C回歸方程，用滿足分離條件的色譜柱中Fs的最大值(即4.325)作為C的最大值；選擇適合分離的色譜柱(RT＞0.8)柱參數(shù)C的最小值，得到柱參數(shù)C的最佳范圍為-0.118到0.772；采用C值替代Fs可更簡(jiǎn)便地縮小色譜柱篩選范圍。用13和14號(hào)色譜柱(C值分別為-0.062和-0.115)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，所得RT均為1，均滿足分離的要求，即根據(jù)C值進(jìn)行篩選可得到理想的色譜柱。

3.2 色譜柱參數(shù)對(duì)R5N的影響

3.2.1 R5N與柱參數(shù)關(guān)系的探討

如圖1所示，在所有雜質(zhì)色譜峰的理論塔板數(shù)中，R5N值均最小，為了考察R5N與柱參數(shù)之間的關(guān)系。將1～12號(hào)色譜柱參數(shù)與R5N按公式(4)用SPSS進(jìn)行逐步回歸，可得方程：

其中P=0.022＜0.05，R=0.917，回歸意義顯著。從方程(7)可以看出，R5N與B2，A，S2呈正相關(guān)，其余參數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中B2對(duì)R5N影響最大。

3.2.2 R5N與色譜柱參數(shù)關(guān)系式的驗(yàn)證

以13和14號(hào)色譜柱對(duì)方程(7)進(jìn)行驗(yàn)證。兩根色譜柱的預(yù)測(cè)理論塔板數(shù)值分別為2606和2555，其實(shí)測(cè)值分別為2781和2497，二者誤差在可接受范圍內(nèi)。說(shuō)明利用該模型(方程)預(yù)測(cè)R5N具有較高的準(zhǔn)確度，分析人員在試驗(yàn)前通過(guò)對(duì)金霉素理論塔板數(shù)的預(yù)測(cè)，可以避免無(wú)目標(biāo)的試驗(yàn)。

3.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用適宜于四環(huán)素分析的14號(hào)色譜柱(依據(jù)C值預(yù)測(cè)，該色譜柱的R12可以達(dá)到2.5)，對(duì)鹽酸四環(huán)素原料和四環(huán)素片樣品分別進(jìn)行分析。片劑與原料樣品的色譜圖均較理想(圖5)，均檢出雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3和雜質(zhì)6，含量分別為5.54%、0.27%、0.06%、0.21%和1.51%、0.10 %、0.01%和0.14%，但均未檢出5號(hào)雜質(zhì)金霉素。樣品中難分離雜質(zhì)對(duì)(1號(hào)和2號(hào)雜質(zhì))的分離度R12分別為2.59和2.49，與預(yù)測(cè)值基本一致。由于實(shí)際樣品中1號(hào)和2號(hào)雜質(zhì)的含量差異非常大，如果選用了不適宜的色譜柱使得二者的分離度不夠，2號(hào)雜質(zhì)很可能被較大的1號(hào)雜質(zhì)重疊包裹而無(wú)法檢出。

3.4 討論

對(duì)于色譜柱的相似度計(jì)算， Snyder等提出了經(jīng)典公式

一般認(rèn)為Fs小于3時(shí)，用兩個(gè)色譜柱進(jìn)行分離具有相似效果，F(xiàn)s大于3的色譜柱之間具有不同選擇性[14]。但在本例中，用方程(8)計(jì)算的結(jié)果繪制Fs-RT散點(diǎn)圖如圖3(B)所示，即使將Fs允許的限度從3提至40，原本符合分離要求的11號(hào)色譜柱也將被排除在外。而按方程(6)計(jì)算得到的數(shù)據(jù)與結(jié)果吻合程度更優(yōu)，F(xiàn)s在0到4.325之間，可以選到較為合適的色譜柱，證明采用公式(6)預(yù)測(cè)正確率高于Snyder等提出的方程。另外，F(xiàn)s的計(jì)算通常采用全部的柱參數(shù)，而對(duì)于特例，難分離溶質(zhì)對(duì)的分離僅和一個(gè)或幾個(gè)參數(shù)有關(guān)，此時(shí)Fs值無(wú)法反映真實(shí)分離情況。本文通過(guò)對(duì)鹽酸四環(huán)素各有關(guān)物質(zhì)的分離分析，發(fā)現(xiàn)柱參數(shù)C是影響R12的主要因素，在實(shí)際分析時(shí)，選擇C參數(shù)在-0.118到0.772之間，R12實(shí)際分離效果較好。與計(jì)算Fs相比，以C參數(shù)來(lái)篩選滿足分離度R12的色譜柱，也可避免復(fù)雜的相似度公式計(jì)算。

R5N與色譜柱靈敏度密切相關(guān)，如1號(hào)色譜柱的R5N較低(2263.902)，用該色譜柱所測(cè)得金霉素雜質(zhì)的檢測(cè)限為1.022 μg/mL；而用R5N較高的5號(hào)色譜柱(3072.356)測(cè)得金霉素雜質(zhì)的檢測(cè)限為0.45 μg/mL，靈敏度大大提高。

4 結(jié)論

目前色譜柱生產(chǎn)廠商眾多，型號(hào)特性也各不相同，在有關(guān)物質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行時(shí)往往難以選擇。與以往的盲目試錯(cuò)法相比，用柱參數(shù)來(lái)輔助篩選合適的色譜柱，不僅節(jié)約成本，而且減少耗時(shí)，極大提高了試驗(yàn)的成功率。本文利用柱參數(shù)模型對(duì)鹽酸四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)分析中關(guān)鍵目標(biāo)因子的影響進(jìn)行了探討，便于實(shí)驗(yàn)人員快速篩選出可獲得滿意分離度和理論塔板數(shù)的色譜柱，也為其他抗生素有關(guān)物質(zhì)分析的色譜柱選擇提供了借鑒與參考。同時(shí)建議在中國(guó)藥典等藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)部分系統(tǒng)適用性要求較高的HPLC方法，應(yīng)在“色譜條件-填充劑”項(xiàng)下給出適宜的關(guān)鍵柱參數(shù)范圍，便于執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)時(shí)選擇合適的色譜柱，以得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。