子宮內膜再生細胞通過表達PD-L1對大鼠腸道缺血再灌注損傷的抑制作用觀察

葉奎，彭秋鳳，史剛剛，曲鑫，王浩

1 天津市第四中心醫院血管外科，天津 300142；2 天津醫科大學第二醫院肛腸外科；3 天津醫科大學總醫院普通外科；4 天津普通外科研究所

腸道缺血再灌注損傷（IRI）是指由于不同病因導致腸道血供中斷，恢復血供后出現損傷加重甚至不可逆損傷的現象［1］。腸道IRI發生后，由于局部腸道組織氧化應激加劇，局部炎癥反應亢進，腸道屏障被破壞，腸道細菌移位，繼而誘發全身炎癥反應綜合征［2］。近些年來，基于干細胞的治療方法對于缺血性疾病以及腸道IRI 的治療效果較好［3］。子宮內膜再生細胞（ERC）作為一種來源于育齡期女性月經血的新型類間充質干細胞，具有減輕機體缺血損傷、促進損傷修復、調節機體免疫平衡等作用，在再生醫學以及細胞治療領域中應用廣泛［4］。既往研究發現，程序性死亡配體1（PD-L1）能夠在ERC表面表達，且能夠作為發揮免疫調節作用的有效靶點［5］。但是，目前ERC 能否通過表達PD-L1 減輕腸道IRI 及其潛在機制均不明確。為此，我們于2021 年1 月—9 月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：Wistar 雄性大鼠50 只，7～8周齡，體質量200～220 g，均購自中國食品藥品檢定研究院［生產許可證為SYXK（京）2019-0001］。主要試劑：胎牛血清（FBS）和DMEM 細胞培養基均購自美 國Hyclone 公 司；抗 大 鼠CD45、CD79、CD90、CD105、HLA-DR 及抗人PD-L1等流式抗體均購自美國eBioscience 或Biolegend 公司，大鼠白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）細胞因子檢測試劑盒均購自北京達科為生物科技有限公司，二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸（DLac）均購自南京森倍伽生物科技有限公司；青—鏈霉素、HE染色試劑盒、淋巴細胞分離液（Ficoll配制）均購自北京索萊寶生物技術有限公司；重組人干擾素γ（IFN-γ）購自美國Peprotech 公司，抗PD-L1 單克隆抗體（克隆號：M1H2）購自賽默飛科技有限公司。

1.2 ERC的制備及鑒定

1.2.1 ERC 制備 本研究經天津醫科大學總醫院倫理委員會審批通過（倫理審批文書批號：IRB2021-WZ-132）。將15 mL 淋巴細胞分離液置于50 mL 離心管中備用，利用月事杯收集2 位健康育齡期（25～35 周歲）女性志愿者的月經血，用含青—鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）和月經血按照1∶1 的體積比進行混合，緩慢滴加15 mL 混合液于淋巴細胞分離液上，2 000 r/min進行密度梯度離心，取中間云霧層細胞。用10 mL PBS 重懸細胞，洗滌3 次，用含15%FBS 的DMEM 培養基重懸細胞，接種于培養皿上。3 d后第一次更換一半培養基，之后每2～3 d更換全部培養基，待細胞密度達90%時，用0.25%胰酶消化細胞，含10% FBS 的DMEM 培養基進行傳代培養。

1.2.2 ERC 鑒定 取傳代至第3 代的細胞，胰酶消化后觀察細胞形態并進行流式細胞術鑒定。細胞形態觀察結果顯示，月經血來源的單核細胞分離后72 h呈現米粒樣，更換培養基后細胞逐漸變為梭形，7～10 d 后細胞逐漸長成類似于間充質干細胞樣的巢狀集落（OSID 碼圖1A）；流式細胞術檢測結果顯示，該ERC 能夠高表達CD90 和CD105，低表達或不表達CD79、HLA-DR、CD45（OSID 碼圖1B），符合間充質干細胞的表面鑒定標準。

1.3 IFN-γ 對ERC 表 面PD-L1 表 達 影 響 的 觀 察按照既往發表文獻［6］的方法，取傳代至第4 代的ERC，細胞貼壁后向培養體系中加入重組人IFN-γ 5 ng/mL，72 h 后收集細胞，通過流式細胞術檢測細胞表面PD-L1表達情況。結果顯示，IFN-γ刺激前后ERC 表面PD-L1 陽性表達率分別為29.577% ±1.279%、62.823% ± 3.651%，二者比較P＜0.01；證實IFN-γ可以刺激ERC高表達PD-L1（OSID碼圖2）。

1.4 動物模型構建與分組處理 所有大鼠飼養以及動物操作均在天津醫科大學總醫院普通外科研究所完成，動物實驗操作經過天津醫科大學總醫院動物福利倫理委員會批準（批件號：IRB2021-DW-31）。50只Wistar大鼠提前12 h禁食，自由飲水，隨機分為假手術組、模型組、PD-L1 過表達ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達ERC 組，每組10 只。除假手術組外，均利用腸系膜上動脈結扎30 min 后恢復血供的方法［7］建立腸道IRI大鼠模型，假手術組開腹后分離腸系膜上動脈但不結扎。建模后，PD-L1 過表達ERC 組、ERC 治療組和PD-L1 低表達ERC 組分別通過尾靜脈注射的方法，給予5 ng/mL IFN-γ 預刺激72 h 后的ERC、普通ERC、10 μg/mL 抗人PD-L1 抗體作用72 h后的ERC各5×106個。

1.5 腸道組織損傷情況觀察 采用HE 染色。各組分組處理72 h后處死，收集腸道組織，10%甲醛固定48 h，進行脫水、包埋、切片、染色，具體實驗步驟參照HE 染色試劑盒說明書。按照Chiu's 評分評價腸道組織損傷情況，評分標準：正常腸絨毛結構為0分，絨毛頂端黏膜下出現間隙、毛細血管充血為1分，黏膜下間隙擴大、腸黏膜與黏膜下層分離為2分，黏膜與黏膜下層分離延伸到腸絨毛兩側為3分，絨毛變鈍、固有層及其血管暴露、炎癥組織浸潤為4分，固有層消化崩解、出血或形成潰瘍為5分。

1.6 血清腸道屏障功能相關指標及炎癥因子水平檢測 各組分組處理72 h處死前，收集外周血，分離獲得血清，采用ELISA 法檢測血清腸道屏障功能相關指標D-Lac、DAO 及炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件。計量資料采用夏皮羅—威爾克正態性檢驗，呈正態分布以-x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腸道組織損傷評分比較 假手術組、PD-L1 過表達ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達ERC 組、模型組腸道組織損傷評分分別為（0.500 ±0.534）、（2.000±0.535）、（2.875±0.641）、（3.750±0.463）、（4.125 ± 0.641）分，組 間 兩 兩 比 較P均＜0.05。

2.2 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 假手術組、PD-L1 過表達ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達ERC 組、模型組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1。

表1 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（±s）

表1 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PD-L1過表達ERC組比較，△P＜0.05；與ERC治療組比較，▲P＜0.05。

組別假手術組模型組PD-L1過表達ERC組ERC治療組PD-L1低表達ERC組n 10 10 10 10 10 D-Lac（μg/L）512.945± 58.930 1 699.428±170.430*1 480.424±106.753*#1 416.698±123.726*#△1 197.025±131.792*#△▲DAO（pg/mL）30.434± 6.097 137.755±10.937*119.193± 8.364*#101.065±12.319*#△77.121± 7.856*#△▲TNF-α（pg/mL）182.871±39.517 588.089±65.933*354.059±72.029*#458.745±80.550*#△561.144±70.905*#△▲IL-6（pg/mL）240.701±67.557 821.415±99.461*419.478±90.166*#545.165±63.249*#△660.323±62.866*#△▲IL-1β（pg/mL）76.513±14.347 158.104±18.850*84.120±10.982*#104.021± 7.653*#△124.383±12.512*#△▲

3 討論

腸道IRI 是一種繼發于腸系膜上動脈栓塞、失血性休克、小腸移植等疾病的嚴重并發癥，該過程有多種因素共同參與；腸道在缺血階段組織細胞代謝水平下降，大量損傷相關模式分子和促炎因子釋放，在恢復血供時大量含氧血流灌注加重損傷，從而促進炎癥細胞因子釋放，局部組織炎癥反應劇烈，大量炎癥細胞浸潤，導致腸道屏障破壞，腸道細菌移位至外周血，造成全身系統性炎癥反應［8-11］。近年來，以干細胞為基礎的治療策略有望成為預防或抑制IRI的有效措施［3，5，12］。間充質干細胞作為一種成體干細胞，一方面能夠抑制局部炎癥反應，另一方面能夠釋放大量促血管生成因子以及營養因子，從而促進局部損傷組織的修復。ERC 是一種新型的類間充質干細胞，來源于育齡期女性的月經血。課題組前期研究發現，ERC 能夠有效抑制小鼠肢體缺血，促進腎臟缺血再灌注損傷的修復，抑制刀豆蛋白A 誘導的急性肝損傷，治療小鼠實驗性結腸炎以及誘導小鼠異位心臟移植術后的免疫耐受等，為IRI 的治療提供了廣闊的應用前景［13-16］。PD-L1 是程序性死亡受體的配體，能夠與PD-1 結合，從而抑制免疫排斥反應［17］。本課題組前期研究發現，ERC 能夠通過表達PD-L1 來誘導調節性T 細胞（Treg）生成，促進M2型巨噬細胞極化，從而抑制局部炎癥反應和調節免疫，最終誘導小鼠心臟移植后的免疫耐受［9，18］。在缺血性疾病中，ERC 可能釋放大量的血管內皮生長因子（VEGF），有助于促進局部組織損傷修復和微循環形成。

本研究首先利用IFN-γ 刺激ERC，從而使其高表達PD-L1，這一結果也得到既往發表文獻的支持［19］。在正常的生理狀態下，人體內血液中D-Lac水平較低，而當腸道細菌大量增殖酵解，導致腸道屏障功能紊亂時，大量D-Lac 釋放入血，使得外周血中D-Lac 水平升高。DAO 是哺乳動物腸道黏膜上層絨毛細胞中具有高度活性的細胞內酶分子，外周血DAO 升高提示腸道屏障功能被破壞。同時，外周血細胞因子水平能夠反映機體的炎癥狀態。本研究結果顯示，假手術組、PD-L1 過表達ERC 組、ERC 治療組、PD-L1低表達ERC組、模型組腸道組織損傷評分及血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均依次升高；提示高表達PD-L1 的ERC 相較于未處理的ERC 或低表達PD-L1 的ERC 能夠對腸道IRI 發揮更好的治療效果，同時可以減輕腸道屏障功能損傷、降低促炎細胞因子表達，也證實了ERC 表面表達PDL1是其發揮治療效果的重要靶點。本研究阻斷PDL1 后的ERC 相較于模型組仍然具有良好的治療效果，這說明了PD-L1 不是ERC 發揮功能的惟一效應分子，ERC 可能還存在其他發揮效應功能的分子，仍有待進一步研究［19］。

綜上所述，ERC 能夠通過表達PD-L1 而減輕大鼠腸道IRI 損傷，其機制可能與降低腸道屏障功能損傷及炎癥反應有關，但是其具體的調控通路及調控因子仍需深入研究。在未來的工作中，我們可以通過基因轉染技術來促進ERC 表面PD-L1 過表達，以獲得治療級別的種子細胞，甚至可以進一步獲取高表達PD-L1的ERC細胞外泌體，從而進行腸道IRI的治療。