活性肽灌胃對阿爾茨海默病大鼠的神經保護作用及海馬組織Wnt/β-catenin信號通路活性影響

楊新柱，趙效國，馬依拉·買買提，呂逸霏，李莉

1 新疆醫科大學公共衛生學院，烏魯木齊 830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院臨床營養科

阿爾茨海默?。ˋD）是一種中樞神經系統性疾病，在老年人群中高發，是老年癡呆最常見的類型之一［1］。AD 主要表現為漸進性記憶與理解功能障礙，神經精神方面表現為性格發展及語言功能障礙，嚴重影響患者的職業、社交與生活能力［2］。AD 的病因、發病機制尚不明了，其特征性病理表現為β淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積形成的老年斑、tau 蛋白過度磷酸化導致的中樞神經細胞纖維纏結（NFTs）及神經元大量丟失等，目前尚無有效的治療藥物［3-5］。活性肽是通過脂質體包裏技術特殊處理的特種乳清蛋白，其獲取需首先通過蛋白水解獲得各分子量多肽的集合，然后采用分子膜過濾將上述多肽混合物依照目標分子量進行篩選，最終得到目標分子量的大分子多肽?；钚噪脑隗w內高效利用，可調節和提高體內生長激素水平，促進全身蛋白質合成，調節和平衡人體內的各項激素水平，其作為內源性干細胞激活劑可全面修復、恢復受損細胞及衰老細胞功能，從而提高和改善人體器官的各項機能。2019年9月—2022年1月，本研究觀察了活性肽對AD大鼠的神經保護作用，并探討其可能的機制，為AD 的藥物預防及治療提供新的實驗依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性SD 大鼠72 只，12～16周齡，體質量（250±50）g，由新疆醫科大學實驗動物管理中心供應，質量合格編碼［SCXK（新）2019-0002］；大鼠在SPF 級實驗室常規飼養，保持足夠的通風和照明條件，每籠飼養3～4 只，自由進食和飲水。主要藥物及試劑：活性肽（乳清蛋白粉復合粉）購自上海十多生物科技有限公司，D-半乳糖（DGal）、鹽酸多奈哌齊購自上海麥克林生化科技有限公司；β-連環蛋白（β-catenin）抗體購自英國Abcam公司，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）抗體、GAPDH 抗體均購自北京博奧森海洋生物科學技術公司；動物組織總RNA 提取試劑盒、第一鏈合成試劑盒、熒光定量試劑盒均購自北京天根生化研究股份公司，BCA 蛋白含量測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器：Morris 水迷宮視頻圖像監控分析控制系統購自成都泰盟科技有限公司，QutantStudio6實時熒光PCR 儀、Nanddrop000/000C 分光光度計均購自美國Thermo公司。

1.2 動物分組與處理方法 72 只SD 大鼠適應性飼養1周，隨機分成空白組、模型組、多奈哌齊組、活性肽低劑量組、活性肽中劑量組、活性肽高劑量組，每組12 只。除空白組外，其余各組腹腔注入D-gal 150 mg/kg、1 次/天，以建立AD 模型，空白組腹腔注入等量生理鹽水，連續注入60 d。多奈哌齊組、活性肽低劑量組、活性肽中劑量組、活性肽高劑量組建模的同時分別灌胃給予多奈哌齊0.9 mg/（kg·d）及活性肽420、630、840 mg/（kg·d），1次/天，連續60 d。

1.3 學習記憶能力觀察 采用Morris 水迷宮測試。各組分組處理60 d，開展Morris 水迷宮實驗，實驗共歷時6 d，分為定位航行實驗及空間探索實驗。①定位航行實驗：將各組大鼠從固定的象限中央面向池壁放入水中，記錄其120 s 內找到平臺的時間，即為逃逸潛伏期；超過120 s 而未找到者，引導其爬上平臺并停留10 s，訓練進行5 d，2 次/天。②空間探索實驗：各組大鼠第6 天撤去平臺，記錄其120 s 內進入有效區域（1.5倍原平臺所在區域）的次數。

1.4 海馬組織病理觀察 采用HE 染色。各組分組處理60 d，隨機選取4 只大鼠，1%戊巴比妥鈉0.45 mL/100 g腹腔注射麻醉，待大鼠昏迷后置于解剖盤，暴露其心臟，將灌流針在左心室插入并固定；切開右心耳，緩慢灌注提前冰凍（4 ℃）的無菌生理鹽水150 mL，至大鼠鼻尖蒼白，肝、肺臟顏色從紅轉白，右心耳流出澄清液體后，再灌注4%多聚甲醛200 mL；待大鼠四肢抽搐痙攣，斷頭取腦，并于冰臺上剝離大腦雙側海馬，4%多聚甲醛固定，制片備用。依次進行梯度乙醇脫水、組織透明、浸蠟、包埋后，將海馬組織冠狀切成4μm 厚度的石蠟切片。切片經烘烤數小時后，脫蠟液脫蠟、透明、脫水處理后，在無菌水浸洗后，蘇木素染色1 min，1%鹽酸乙醇分化，再次充分沖洗；1%伊紅染色1 min，梯度脫水、脫蠟液透明、中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察各組海馬組織病理改變。

1.5 海馬組織β-catenin 陽性表達情況觀察 采用免疫組化法。取各組海馬組織冠狀切片，復水后將切片用3%過氧化氫溶液室溫浸泡10 min，蒸餾水水洗3 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗片3 次，每次5 min；置枸櫞酸鹽緩沖液中，微波修復（92～98 ℃）12 min；室溫冷卻至常溫，PBS 沖洗3 次；抗原修復后，置于5%BSA中封閉30 min；去除封閉液，滴加稀釋后的多克隆兔抗β-catenin（1∶500），4 ℃冰箱孵育過夜。次日使用PBS 沖洗3 次，在切片組織表面滴加稀釋后的辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS 沖洗3 次，向組織表面均勻滴加DAB 顯色液顯色60 s，直至在顯微鏡下觀察到組織出現棕黃色，自來水終止；蘇木素復染1 min，鹽酸分化，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組海馬組織β-catenin蛋白定位及數量等。

1.6 海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA 表達檢測采用Real-time PCR法。取各組分組處理60 d的剩余大鼠，心臟灌注后取出大腦，分離海馬組織，置于液氮中速凍并轉移至-80 ℃冰箱保存。稱取海馬組織20 mg，加入裂解液、研磨珠，在自動研磨儀研磨數次后，提取海馬總mRNA。檢測各樣本mRNA 純度，在260、280 nm 處測定吸光度A260/A280為1.9～2.0 時，進行逆轉錄。使用實時熒光定量PCR 儀進行擴增，GSK-3β、β-catenin及內參GAPDH的引物序列由上海生工生物工程股份公司設計合成，引物序列見表1。PCR 擴增條件：95 ℃、15 min，循環1 次；95 ℃、10 s，60 ℃、32 s，循環40 次；65～95 ℃繪制溶解曲線。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 GSK-3β、β-catenin及內參GAPDH的引物序列

1.7 海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。將1.6 中凍存的各組大鼠海馬組織取出，剪成200～500 mg的組織，加入250～500μL RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，于研磨儀充分勻漿。4 ℃條件下14 000 r/min 離心10 min，取上清液。BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，繪制標準曲線，計算各樣本濃度，加入RIPA使各樣本濃度歸一化。采用聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）制膠、電泳，濕轉法將蛋白轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。將PVDF 膜浸泡在稀釋后的β-catenin（1∶5 000）、GSK-3β（1∶1 000）的一抗中，4 ℃搖床孵育過夜；次日將洗滌后的PVDF 膜浸泡在二抗（1∶5 000）中，室溫孵育1 h。洗膜后將PVDF 膜浸泡在ECL 化學發光劑中，取出后凝膠成像儀曝光顯色。用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk正態性檢驗方法，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期及進入有效區域的次數比較 與空白組比較，模型組大鼠逃逸潛伏期明顯延長，進入有效區域的次數明顯減少（P均＜0.05）。與模型組比較，多奈哌齊組、活性肽高劑量組大鼠逃逸潛伏期均縮短、進入有效區域的次數明顯增多（P均＜0.05），而活性肽低、中劑量組變化不明顯（P均＞0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠逃逸潛伏期、進入有效區域的次數比較無統計學差異（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期及進入有效區域的次數比較（±s）

表2 各組大鼠逃避潛伏期及進入有效區域的次數比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05；與活性肽低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 12 12 12 12 12 12逃逸潛伏期（s）26.94±2.49 39.31±3.70*28.94±3.34#32.75±3.61 31.81±2.90 24.33±1.90#▲進入有效區域次數（次）8.50±2.62 5.88±2.48*10.88±3.00#7.00±2.39△7.50±2.88△8.63±2.56#▲

2.2 各組大鼠海馬組織病理變化比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬區錐體細胞排列紊亂，較多神經細胞體積縮小，出現細胞核固縮，并且神經元數量明顯下降，錐體細胞也出現較多損傷。與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組神經元數量明顯增多、形態較完整，其中活性肽高劑量組與多奈哌齊組海馬區錐體細胞大多數形態較正常、細胞排列較為整密、核仁結構清晰、著色均勻。見OSID碼圖1。

2.3 各組大鼠海馬組織β-catenin陽性表達比較 各組大鼠海馬組織β-catenin蛋白主要定位于細胞質，陽性細胞呈黃褐色。與對照組比較，模型組大鼠海馬組織β-catenin蛋白陽性細胞著色淺，而且陽性細胞數較少，細胞較分散。與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織β-catenin蛋白陽性細胞數量均增多，染色較深。見OSID碼圖2。

2.4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 表達升高、β-catenin mRNA 表達降低（P均＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 表達均降低，β-catenin mRNA 表達均升高（P均＜0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA 表達比較均無統計學差異（P均＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05；與活性肽低、中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 4 4 4 4 4 4 GSK-3β mRNA 1.01±0.18 1.81±0.68*0.79±0.34#1.41±0.10 1.16±0.46#0.85±0.37#β-catenin mRNA 1.00±0.11 0.38±0.22*1.87±0.52#1.20±0.52＃△1.56±0.15#1.61±0.16#

2.5 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬組織GSK-3β蛋白表達升高、β-catenin蛋白表達降低（P均＜0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β蛋白表達均降低，β-catenin蛋白表達均升高（P均＜0.05）。多奈哌齊組和活性肽高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin 蛋白表達比較均無統計學差異（P均＞0.05）。見表4、圖1。

表4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達比較（±s）

表4 各組大鼠海馬組織GSK-3β、β-catenin蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與多奈哌齊組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組多奈哌齊組活性肽低劑量組活性肽中劑量組活性肽高劑量組n 4 4 4 4 4 4 GSK-3β 0.72±0.50 1.07±0.11*0.70±0.16#0.71±0.18#0.62±0.09#0.72±0.16#β-catenin 0.79±0.76 0.53±0.38*0.99±0.15#0.75±0.17△1.09±0.17#1.00±0.75#

圖1 各組大鼠海馬組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達條帶圖（Western blotting法）

3 討論

AD 病因復雜多樣，其發病機制尚不十分明確，目前沒有有效的治療手段［6］。在世界老齡化日益加重的趨勢下，AD 發病率逐年上升，已成為一個不容忽視的公共健康問題［7］。研究表明，D-gal 能導致動物亞急性衰老，在細胞內大量堆積可引起細胞代謝功能紊亂，以致體內活性氧增多，從而損害生物膜及其他高分子功能和結構，并導致機體多器官、多系統功能衰退［8］。此外，AD 患者腦組織中出現明顯的過氧化反應，D-gal可通過產生過量活性氧和氧自由基引起氧化應激損傷和抗氧化機制失衡，加快腦組織退化過程［9-11］。本研究通過腹腔注射D-gal 建立AD模型，結果顯示與空白組比較，模型組大鼠海馬區錐體細胞排列紊亂，較多神經細胞體積縮小，出現細胞核固縮，并且神經元數量明顯下降，錐體細胞也出現較多損傷，且逃逸潛伏期升高、進入有效區域的次數降低，提示AD 模型建立成功。本研究結果顯示，與模型組比較，多奈哌齊組及活性肽低、中、高劑量組大鼠逃逸潛伏期均降低，進入有效區域的次數均升高，以多奈哌齊組、活性肽高劑量組變化更明顯；提示活性肽有助于提高AD 大鼠的學習記憶能力，且高劑量活性肽效果更好，與多奈哌齊效果相當。

Wnt/β-catenin 信號通路與中樞神經系統的生長發育有著密切關系，在成年海馬神經發生中對神經細胞的增殖、分化具有關鍵作用，Wnt信號通路的持續激活可以促進神經細胞的增殖、分化［12］。GSK-3β 和β-catenin 是Wnt信號通路中的重要蛋白，一般正常細胞質中游離β-catenin 水平極低，不能產生Wnt 信號；當信號通路的某些成分發生質或量的變化時，Wnt 信號通路被激活，Wnt 信號與細胞表面受體結合，使細胞質內GSK-3β 復合體受到抑制，阻止β-catenin 磷酸化過程，進而使β-catenin 進一步聚集，從而轉移到細胞核中，激活轉錄并調節靶基因表達［13-15］。近期研究也證明，當Wnt/β-catenin 信號通路被抑制時，會導致GSK-3β 表達升高和β-catenin表達水平降低，進而引起Aβ 異常沉積和tau 蛋白過度磷酸化，最后導致AD 的發生［16-17］。本研究結果顯示，模型組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 和蛋白表達高于空白組，β-catenin mRNA 和蛋白表達低于空白組，說明AD 大鼠海馬中Wnt/β-catenin 信號通路被抑制；而多奈哌齊組和活性肽低、中、高劑量組大鼠海馬組織GSK-3β mRNA 和蛋白表達均低于模型組，β-catenin mRNA 和蛋白表達均高于模型組，且多奈哌齊組和活性肽高劑量組比較并無統計學差異；說明活性肽可以激活Wnt/β-catenin 信號通路，高劑量活性肽對于AD 大鼠的神經保護作用及Wnt/βcatenin信號通路激活作用與多奈哌齊效果相當。

綜上所述，活性肽對AD 大鼠具有神經保護作用，且劑量越高效果越好，其機制可能與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關，為AD 的早期預防和治療奠定了實驗基礎。