過/降表達miR-20a-5p 的骨肉瘤細胞增殖、侵襲能力及Bax、Bcl-2、E2F5蛋白表達觀察

郭會，方艷君，李翠娥，段祥林

協和武漢紅十字會醫院骨科，武漢 430000

骨肉瘤（OS）是一種原發性惡性腫瘤，好發于兒童和青少年，由未成熟骨和產生類骨質的間充質細胞組成，其復發率和轉移率均比較高，手術切除聯合放化療是治療OS 的主要方法，患者預后不佳，5 年生存率低于20%［1-2］。深入研究OS 的發病機制，對于了解OS 的發病及探索新療法具有重要意義。微小RNA（miRNA）是短鏈小RNA 分子，不能編碼蛋白質表達，可通過靶向mRNA 的3'非翻譯區（3'-UTR）負調控基因表達［3］。miRNA 已被證明參與細胞增殖、遷移、炎癥和細胞凋亡等多種生物學過程，可作為致癌基因或抑癌基因，在腫瘤發生過程中發揮重要調節作用［4］。研究顯示，miR-20a-5p 在非小細胞肺癌組織中高表達，且可促進細胞增殖和轉移［5］。但miR-20a-5p 在OS 細胞中的表達變化及其對細胞增殖、侵襲能力的影響鮮見報道，為此我們于2020年1月—2021年1月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：OS 細胞系（U-20S、143B、Saos-2）及正常人成骨細胞系hFOB1.19 均購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）。主要試劑：RPMI 1640 培養基購自美國Gibco 公司，10%胎牛血清、TRIzol 試劑、TaqMan Power SYBR Green PCR Mix 試劑盒、膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒、LipofectamineTM3000均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，蛋白印跡試劑盒、羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物技術有限公司，EntiLinkTMcDNA 合成試劑盒購自湖北ELK Biotechnology 公司，E2F 轉錄因子5（E2F5）、Bcl-2、GAPDH 一 抗 均 購 自 美 國Invitrogen 公 司，Bax 一 抗購自美國Santa Cruz 公司，miR-20a-5p PCR 引物序列、miR-20a-5p 過表達質粒（miR-20a-5p mimics）、miR-20a-5p 抑制質粒（miR-20a-5p inhibit）及陰性對照質粒（scramble）序列均由廣州銳博生物公司設計合成。

1.2 細胞miR-20a-5p 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。將OS 細胞系（U-20S、143B、Saos-2）及正常人成骨細胞系hFOB1.19 置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。使用TRIzol 試劑提取總RNA，PrimeScript RT試劑盒、miR-20a-5p 引物和1μg 總RNA 合成第一鏈互補DNA（cDNA），使用EntiLinkTM第一鏈cDNA 合成試劑盒逆轉錄合成第一鏈cDNA。使用TaqMan Power SYBR Green PCR Mix 試劑盒在Applied Biosystems 7500 實時PCR 系統上行PCR 檢測。PCR反應條件：95 ℃5 min ；95 ℃10 s 、59 ℃30 s 、72 ℃30 s ，共40 個循環。miR-20a-5p 引物序列：上游引物5'-GCCTCTCGCTCAACTGAATTG-3'、下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'，內參U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGGCAGCACAT-3'、下游引物5'-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt法計算miR-20a-5p相對表達量。

1.3 細胞培養及分組處理 將OS 細胞系143B 隨機分為miR-20a-5p 過表達組、miR-20a-5p 抑制表達組及陰性對照組，通過LipofectamineTM3000 分別轉染miR-20a-5p mimics、miR-20a-5p inhibit 及scramble，轉染24 h。參照1.2 采用實時熒光定量PCR 法檢測三組miR-20a-5p 相對表達量，結果顯示miR-20a-5p 過表達組、陰性對照組及miR-20a-5p 抑制表達組miR-20a-5p 相對表達量分別為9.14 ± 0.26、3.12 ± 0.15、0.46 ± 0.08，組 間 兩 兩 比 較P均＜0.05；提示轉染成功。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。將三組細胞以5×103/孔接種到96孔板上，37 ℃條件下孵育過夜。每孔加入10μL CCK-8 試劑，再孵育2 h。三組細胞培養0、24、48、72 h，使用酶標儀檢測每孔490 nm 處的光密度值（OD 值）。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取對數生長期的三組細胞，預冷的70%乙醇固定，加入5 μL 碘化丙啶（PI）和10 μL Annexin V-FITC，室溫避光染色15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell 小室實驗。將對數生長期的三組細胞接種在Transwell 侵襲小室上室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基。孵育24 h 后，用棉簽除去保留在上室的細胞，用甲醇和0.1%結晶紫固定穿膜細胞，200 倍光學顯微鏡下計數10 個視野內的穿膜細胞數，取平均值。

1.7 miR-20a-5p 靶向蛋白的確定 采用熒光素酶報告基因實驗。在線數據庫TargetScan（http：//www. targetscan. org/vert_71/）預測miR-20a-5p 的直接靶基因，結果顯示E2F5存在與miR-20a-5p結合的潛在靶點，見圖1。將含有野生型（WT）或突變型（MUT）miR-20a-5p 結合位點的E2F5 3'-UTR 片段克隆到熒光素酶基因中，建立WT-E2F5 和MUT-E2F5兩個報告質粒。將熒光素酶報告基因實驗通用的293 細胞系分為四分部分，分別將WT-E2F5、MUTE2F5 與miR-20a-5p mimics、對照載體使用LipofectamineTM3000進行共轉染。共轉染48 h，以海腎熒光素酶活性作為內源對照，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶相對活性。結果顯示，共轉染WT-E2F5 和miR-20a-5p mimics 的細胞熒光素酶相對活性為0.41±0.03，共轉染WT-E2F5和對照載體的細胞為1.01 ± 0.03，二者比較P＜0.05；共轉染MUT-E2F5 和miR-20a-5p mimics 的細胞熒光素酶相對活性為1.02 ± 0.02，共轉染MUT-E2F5 和對照載體的細胞為1.01±0.04，二者比較P均＞0.05。

圖1 miR-20a-5p直接靶基因的在線數據庫TargetScan預測結果

1.8 細胞Bax、Bcl-2、E2F5 蛋白表達檢測 采用Westen blotting 法。取對數生長期的三組細胞，使用10% SDS-PAGE 分離蛋白質（每條泳道50 μg）。將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下加入含5%脫脂牛奶的TBST，封閉1 h；加入Bax 一抗（1∶300）、Bcl-2一抗（1∶300）、E2F5一抗（1∶200）、內參GAPDH一抗（1∶300），4 ℃條件下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1∶500），室溫下孵育2 h。添加ECL 液后曝光，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 采用GraphPad5.0 統計軟件。計量資料采用偏度和峰度進行正態性檢驗，呈正態分布以-x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OS 及正常成骨細胞系中miR-20a-5p 表達比較 OS 細胞系U-20S、143B、Saos-2 中miR-20a-5p 相對表達量分別為1.94 ± 0.35、1.05 ± 0.13、0.35 ±0.06，均明顯低于正常人成骨細胞系hFOB1.19 中的3.89±0.53（P均＜0.05）。

2.2 三組細胞增殖能力比較 見表1。

表1 三組細胞培養不同時間的OD值比較（±s）

表1 三組細胞培養不同時間的OD值比較（±s）

注：與miR-20a-5p過表達組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05。

組別miR-20a-5p過表達組陰性對照組miR-20a-5p抑制表達組0 h 0.38±0.07 0.36±0.05 0.39±0.05 24 h 0.59±0.03 0.67±0.04*0.89±0.04*#48 h 0.77±0.04 0.90±0.03*1.43±0.03*#72 h 0.98±0.05 1.23±0.06*1.88±0.03*#

2.3 三組細胞凋亡能力比較 miR-20a-5p 過表達組、陰性對照組、miR-20a-5p抑制表達組細胞凋亡率分 別 為14.8% ± 2.3%、7.2% ± 0.9%、2.1% ±0.7%，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖1。

2.4 三組細胞侵襲能力比較 miR-20a-5p 過表達組、陰性對照組、miR-20a-5p抑制表達組侵襲細胞數分別為（50 ± 8）、（189 ± 11）、（387 ± 26）個，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖2。

2.5 三組細胞Bax、Bcl-2、E2F5 蛋白表達比較 見表2、OSID碼圖3。

表2 三組細胞Bax、Bcl-2、E2F5蛋白相對表達量比較（±s）

表2 三組細胞Bax、Bcl-2、E2F5蛋白相對表達量比較（±s）

注：與miR-20a-5p 過表達組比較，*P＜0.05；與陰性對照組比較，#P＜0.05。

組別miR-20a-5p過表達組陰性對照組miR-20a-5p抑制表達組Bax 2.10±0.15 0.95±0.08*0.26±0.05*#Bcl-2 0.24±0.05 0.90±0.10*2.01±0.10*#E2F5 0.30±0.05 0.97±0.06*1.96±0.09*#

3 討論

OS是常見的原發性惡性骨腫癌，表現出異質性的組織學、遺傳和分子特征，最常引起肺轉移［6］。文獻表明，一些miRNA在OS組織中表達失調，并在OS發生過程中充當致癌基因或腫瘤抑制因子［7］。miR-20a-5p是新鑒定的miRNA 分子，基因定位于12號染色體。miR-20a-5p 在肺動脈平滑肌細胞中表達上調，且miR-20a-5p上調可通過靶向ABCA1蛋白促進肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移，并抑制細胞凋亡［8］。依據所結合的靶基因功能不同，miR-20a-5p 在不同腫瘤中扮演著不同的角色。在肝細胞癌中miR-20a-5p 發揮抑癌基因作用，可通過阻滯HGF/ERBB3-NF-κB 信號通路抑制肝細胞癌術后轉移，且miR-20a-5p 低表達與肝癌術后預后差有關［9］。在乳腺癌中miR-20a-5p 發揮抑癌基因功能，且上調miR-20a-5p 可通過靶向調節HMGA2 表達抑制細胞增殖、侵襲，并誘導細胞凋亡［10］。在子宮內膜癌中miR-20a-5p 表達下調，且上調miR-20a-5p 表達可靶向調節Jak1表達，從而抑制子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和黏附能力，起抑癌基因作用［11］。在神經細胞瘤中miR-20a-5p 表達下調，且在SH-SY5Y 細胞系中miR-20a-5p 可通過負調控ATG7 表達而抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡［12］。在鼻咽癌中，miR-20a-5p 可通過靶向Rab27B 表達而增加放療敏感性［13］。miR-20a-5p也可發揮促癌基因功能。在胃癌中miR-20a-5p 表達上調，并促進胃癌抑癌基因WTX 表達下調，且可通過磷酸化PI3K 激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進胃癌進展［14］。在頭頸部鱗癌中miR-20a-5p 表達上調，可下調TNFRSF21表達、上調CCR7表達，并促進細胞增殖、遷移和侵襲能力［15］。本研究結果顯示，miR-20a-5p 在OS 細胞系中表達下調，且上調miR-20a-5p表達可抑制OS細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡；反之，下調miR-20a-5p 表達可顯著促進OS 細胞增殖，并抑制細胞凋亡；這提示miR-20a-5p在OS的發生發展過程中發揮抑癌基因功能。

本研究通過生物信息學分析工具TargetScan 和熒光素酶報告基因實驗證實miR-20a-5p 的潛在靶基因為E2F5。E2F 家族包括E2F1～E2F8 等8 個成員，其中E2F5 基因定位于8q21.2 區，在調控細胞周期G1相關蛋白（p130、p107 及pRb）表達中起至關重要的作用［16］。在肝細胞癌中，沉默E2F5表達可顯著抑制細胞增殖，并引起細胞周期G1/S 期阻滯、抑制細胞侵襲［17］。E2F5 可被眾多miRNA 調控，如miR-154-5p、miR-106、miR-98、miR-128-2、miR-34a 等［18］。在膠質瘤中，E2F5可直接與細胞周期相關基因結合并促進細胞周期進程，沉默E2F5表達可抑制膠質瘤細胞增殖［19］。E2F5 表達下調可抑制人類癌癥中的細胞周期分布和細胞凋亡［20］。研究顯示，miR-154-5p表達上調可通過下調E2F5，而誘導前列腺癌細胞在G1周期停滯［21］。本研究結果顯示，上調miR-20a-5p 表達可顯著降低OS 細胞中的E2F5 表達，因此miR-20a-5p 抑制OS 細胞增殖和侵襲的機制可能與其靶向下調E2F5表達有關。

細胞凋亡的兩條途徑包括內源性及外源性途徑，外源性途徑由腫瘤壞死因子受體1、Caspase-3、Caspase-8 等介導。線粒體途徑即內源性途徑，由凋亡信息刺激引起線粒體外膜通透性發生改變，并引起Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活化，終止DNA修復，并將DNA 裂解成小分子片段，細胞形態發生改變，最終導致細胞凋亡的發生。在引起線粒體外膜通透性改變過程中，Bcl-2 亞家族及Bax 亞家族扮演著重要角色，其中Bcl-2 起抗凋亡作用、Bax 起著促凋亡的作用。本研究結果顯示，上調miR-20a-5p表達可促進OS 細胞凋亡，同時抑制凋亡因子Bcl-2表達下調，而促凋亡因子Bax 蛋白表達上調，這可能解釋了上調miR-20a-5p 表達后可促進OS 細胞凋亡的原因。

綜上所述，miR-20a-5p 在OS 細胞系中表達下調，而上調miR-20a-5p表達可抑制OS細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡，其機制可能與下調E2F5、Bcl-2及上調Bax 蛋白表達有關。由于本研究是體外細胞研究，miR-20a-5p表達在裸鼠和OS患者預后中的作用仍有待研究。