成纖維生長因子17在食管癌組織中的表達及其臨床意義

張 杰，喬亞敏，林 銳

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors, FGFs)家族由一大類生長因子組成，分別存在于不同的多細胞生物體中[1]。FGFs家族有22個成員，通常根據(jù)其序列相似性、生化功能和進化關(guān)系分為7個亞家族[2]。典型的FGFs包括FGF1/2/5、FGF3/4/6、FGF7/10/22、FGF8/17/18和FGF9/16/20等亞家族，屬于旁分泌或自分泌蛋白，結(jié)合并激活跨膜酪氨酸激酶成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)，觸發(fā)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)其生物學(xué)活性[2-3]。這些生長因子是強有力的有絲分裂原，在胚胎發(fā)育、傷口愈合和細胞分化中起著重要作用[1,4-5]。FGFs在血管生成和腫瘤發(fā)生中也很重要[6-8]。本研究旨在探討FGF17在食管癌組織中的表達水平，以及與食管癌患者臨床病理表征、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般材料收集2016年1月至2021年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的174例食管癌患者的腫瘤組織及對應(yīng)的癌旁正常食管組織(距離癌組織5 cm以上)，男142例，女32例，年齡36～82歲，中位年齡60歲，并獲得患者臨床分期、組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。食管癌組織芯片(HEsoS180Su08)購自上海芯超公司，由114例食管癌組織和66例相鄰癌旁正常食管組織組成，患者均病理診斷為食管癌，術(shù)前未接受放、化療等，手術(shù)時間為2006年4月至2008年12月，光鏡下剔除染色效果差組織殘缺不全的標本，共有106例食管癌組織和61例相鄰癌旁正常食管組織納入研究，男81例，女25例，年齡29～84歲，中位年齡66歲。

1.2 實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)使用RNAiso Plus(美國invitrogen公司)從食管癌組織中分離總RNA，使用Evo M-MLV RT Premix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(批號：A2A0592；湖南艾科瑞生物工程有限公司)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件設(shè)為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒(批號：A3A0426；湖南艾科瑞生物工程有限公司)對cDNA進行PCR反應(yīng)。采用Thermo FisherABI7500 PCR儀進行RT-qPCR,每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，以3-磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)源性對照。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 min,60 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)。以 2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，實驗重復(fù)3次。FGF17基因引物序列：上游引物(F)5’-GCCCAACCTCACTCTGTGCTTAC-3’,下游引物(R)5’-TGCCACTGGTCCTGCTGTAGAG-3’。

1.3 免疫組化染色嚴格按照說明書進行操作步驟。將食管癌組織芯片放入烘箱，溫度調(diào)至63 ℃，烘蠟1 h，后按常規(guī)方法進行脫蠟、水化、乙二胺四乙酸修復(fù)，室溫下過氧化氫浸泡30 min，用加入吐溫后的磷酸鹽緩沖液(PBST)沖洗后滴加一抗鼠抗人FGF17單抗(批號：sc-376056；美國Santa Cruz公司)，4 ℃冰箱過夜，PBST沖洗后加二抗，37 ℃復(fù)溫45 min，PBST清洗，二氨基聯(lián)苯胺進行顯色，蘇木素復(fù)染，晾干后中性樹膠封固。選擇染色清晰的組織芯點進行半定量分析。

1.4 染色結(jié)果判定方法FGF17蛋白在細胞膜或細胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性細胞。本實驗免疫組化結(jié)果參考鹿文峰等[9]的免疫組化結(jié)果評估方式，即半定量積分法，根據(jù)細胞染色強度及陽性細胞所占比例2個指標來判定染色評分。染色強度評分：無色評分為0分、淡黃色評分為1分、棕黃色評分為2分、棕褐色評分為3分。陽性細胞評分標準：陽性細胞≤5%評分為0分、>5%～25%評分為1分、>25%～50%評分為2分、>50%評分為3分。染色強度評分和陽性細胞評分相加，總分0～1分(-)，2分(+)，3～4分(++)，5～6分(+++)，(+++)和(++)認定FGF17蛋白表達陽性，(+)和(-)認定FGF17蛋白表達陰性。

2 結(jié)果

2.1 FGF17基因在食管癌組織中的表達及與患者臨床病理表征的關(guān)系RT-qPCR結(jié)果顯示：食管癌組織中FGF17基因表達水平(8.36±0.51)高于癌旁正常食管組織(8.07±0.44)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.850,P<0.001)；食管癌組織中FGF17基因表達水平與食管癌患者T分期、N分期有關(guān)(χ2=7.436,P=0.006;χ2=8.064,P=0.005)。見表1。

表1 FGF17基因表達與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 FGF17蛋白在食管癌組織和癌旁正常食管組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系免疫組化染色結(jié)果顯示：食管癌組織中FGF17蛋白陽性表達率為74.53%(79/106)，高于癌旁正常食管組織的37.70%(23/61)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.080,P<0.001)。FGF17蛋白高表達患者總生存率明顯低于FGF17蛋白低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.577,P=0.006)。多因素分析結(jié)果表明，F(xiàn)GF17蛋白高表達是影響食管癌患者生存的獨立危險因素(HR=2.084,P=0.005)。見圖1、表2。

圖1 不同F(xiàn)GF17蛋白表達食管癌患者生存曲線比較

3 討論

食管癌是與惡性腫瘤相關(guān)的第6大致死原因[10-12]。食管癌患者發(fā)現(xiàn)時通常已為晚期，因此預(yù)后普遍較差，5 a生存率通常不到10%～25%[13-14]。盡管手術(shù)技術(shù)有所改善，放化療方案和免疫治療方案不斷優(yōu)化，但在過去5 a中，患者總體生存效益并沒有顯著改善[15-16]。因此，尋找與食管癌惡性行為相關(guān)的新的生物分子并闡明潛在的治療靶點是一項艱巨的任務(wù)。FGF17在細胞的發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤生長和侵襲等過程中起重要作用。臨床研究[17]表明，F(xiàn)GF17是疾病進展的潛在預(yù)測因子,前列腺癌組織中FGF17在基因和蛋白水平過表達，其表達與前列腺癌的Gleson Sum評分有關(guān)，且FGF17的高表達與較差的疾病特異性生存期和骨轉(zhuǎn)移的存在相關(guān)性。FGF17不能在血液組織的所有正常成分中表達，但FGF17在急性白血病中表達具有高度的特異性，且與白血病的進展有關(guān)，F(xiàn)GF17可以成為急性白血病診斷的理想生物標志物[18]。

表2 食管癌患者生存的多因素分析結(jié)果

本研究中，RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF17基因在食管癌組織中高表達，且與患者的T分期、N分期有關(guān)。我們通過免疫組化染色檢測FGF17蛋白在食管癌組織及癌旁正常食管組織中的表達發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF17蛋白在食管癌組織中高表達，與生物信息學(xué)結(jié)果相符，且FGF17蛋白高表達患者術(shù)后總生存率顯著低于FGF17蛋白低表達的患者，多因素分析結(jié)果表明FGF17蛋白高表達參與了食管癌的進展，是影響食管癌預(yù)后的獨立危險因素。

總之，F(xiàn)GF17有望成為臨床上食管癌診斷及評估預(yù)后有效的生物標志物，亦可為食管癌的治療提供新的治療靶點。但是，其參與調(diào)控食管癌惡性生物學(xué)行為的表征及其內(nèi)在的分子機制有待進一步研究。