唾液外泌體中口腔鱗癌相關(guān)生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

張芮初, 賈凌飛

(1．北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，北京 100191； 2. 北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，北京 100081)

外泌體始于質(zhì)膜內(nèi)陷形成的內(nèi)吞囊泡，由內(nèi)體膜向內(nèi)出芽構(gòu)成多泡體，在多泡體與質(zhì)膜融合期間經(jīng)胞吐作用被分泌到細(xì)胞外環(huán)境中。外泌體可由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛存在于多種體液中，例如血液、尿液、唾液、乳汁、羊水等[1]。外泌體中內(nèi)容物的變化可以作為診斷及判斷疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物[2]。與血液相比，唾液有易采集、不易凝結(jié)等優(yōu)點(diǎn)，而且唾液中的大部分成分來自于血液，受身體生理和病理變化的影響，全新的無創(chuàng)唾液診斷正在興起[3]。本文僅就唾液外泌體作為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)及口腔潛在惡性疾病(oral potentially malignant disorder, OPMD)相關(guān)潛在生物標(biāo)志物的研究進(jìn)行綜述。

1 唾液外泌體的成分與特性

唾液外泌體為平均直徑30～100 nm的杯狀囊性小泡，具有完整的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，以保護(hù)和運(yùn)載其中的脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)等[2]。

通常唾液外泌體的膜蛋白標(biāo)志物有四跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、水通道蛋白(AQP5)、主要組織相容復(fù)合物Ⅰ類和Ⅱ類蛋白等；其磷脂雙分子層內(nèi)包含了各種細(xì)胞質(zhì)蛋白，如酶、熱休克蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體相關(guān)蛋白，免疫球蛋白IgA和聚合免疫球蛋白受體以及來自親代細(xì)胞的膜融合/轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白等[1-2]。唾液外泌體中也發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞中Wnt5B/β-catenin信號(hào)通路、Delta樣配體4/Notch信號(hào)通路以及泛化素通路等相關(guān)的蛋白[4]。

除蛋白質(zhì)外，唾液外泌體還攜帶大量生物活性物質(zhì)，如mRNA、miRNA以及細(xì)胞因子等。近年來，人們越來越關(guān)注miRNA作為潛在的生物標(biāo)志物，用于診斷、預(yù)后和評(píng)估多種疾病的治療效果。miRNA是小的、非編碼RNA，長度約為19～23個(gè)核苷酸。miRNA通過3’UTR與mRNA結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯后的基因表達(dá)調(diào)控。miRNA參與多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞凋亡、增殖和分化等。研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與越來越多的疾病狀態(tài)有關(guān)，包括惡性腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)退化和自身免疫性疾病等。

2 唾液外泌體的分離

2.1 傳統(tǒng)的外泌體分離方法傳統(tǒng)的外泌體分離方法主要有差速超速離心法、超濾法、尺寸排除色譜法、聚合物沉淀法和免疫分離法。

差速超速離心法利用外泌體在高速旋轉(zhuǎn)時(shí)沉降系數(shù)不同來分離唾液外泌體。該方法產(chǎn)量高，操作簡單，不受分離試劑的污染，是目前應(yīng)用最廣泛的提取外泌體的方法；其缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、操作時(shí)間長、要使用專用的設(shè)備。另外，超高速離心容易引起外泌體破裂，導(dǎo)致收集到的唾液外泌體量變小[6]。

超濾法使用基于不同截留相對分子質(zhì)量的超細(xì)納米膜來選擇性分離樣品，得到外泌體。雖然超濾速度快，不需要任何特殊設(shè)備，但附著在濾過膜上可能會(huì)對唾液外泌體膜造成損害，從而影響其生物活性[7]。尺寸排除色譜法基于凝膠孔徑與樣品分子相對大小的溶質(zhì)分離，可以去除非外泌體結(jié)合的可溶性蛋白和其他污染物，還可將小囊泡與大囊泡分開，但是無法區(qū)分相同大小的外泌體和微泡。這種方法提取的外泌體純度和完整性較好，但是樣品產(chǎn)量少[8]。

聚合物沉淀法是一種最簡單的外泌體分離方法。樣品經(jīng)低速離心預(yù)處理去除細(xì)胞碎片，然后加入聚乙二醇等聚合物與樣品共孵育。該方法可以提取大量的外泌體，但非外泌體顆粒可能與產(chǎn)物共同分離出來，會(huì)影響制備的純度[9]。

免疫分離法利用外泌體表達(dá)常見的靶蛋白，通過磁珠、酶聯(lián)免疫吸附劑測定、流式細(xì)胞術(shù)等捕獲外泌體。其中磁珠法比較常用，該方法是將磁珠涂上相應(yīng)抗原(如抗CD9、抗CD63等)，孵育后與樣品結(jié)合，從而吸附分離樣品中相關(guān)的靶蛋白[7]。該方法提取的外泌體特異性最高，但酸性和低滲溶液不利于外泌體的形態(tài)和生物活性的維持。價(jià)格也限制了其普及。

2.2 基于微流體的分離技術(shù)為了克服以上幾種傳統(tǒng)的外泌體分離技術(shù)的缺陷，微流體利用單個(gè)芯片分離和檢測外泌體，因其簡單、性價(jià)比高、易于自動(dòng)化、能精確處理微尺度、分析時(shí)間短、樣品和試劑消耗量小而受到關(guān)注。尤其是無標(biāo)記的方法在成本、時(shí)間、可重復(fù)性、減少潛在的樣品污染、保持外泌體天然特性方面更具優(yōu)勢[10]。最近Chen等[11]提出的EXODUS超快速外泌體分離系統(tǒng)，在納米多孔陽極氧化鋁雙膜過濾結(jié)構(gòu)中引入雙耦合諧波振蕩，橫波聲控流抑制了結(jié)垢效應(yīng)，避免了流速下降。實(shí)驗(yàn)證明EXODUS在產(chǎn)量、速度和純度上優(yōu)于現(xiàn)有的外泌體分離技術(shù)。

3 唾液外泌體中OSCC的潛在生物標(biāo)志物

OSCC占口腔癌的90%以上，可發(fā)生在上下頜牙齦、舌、頰部、口底、顎部等部位，5 a生存率只有50%左右，早發(fā)現(xiàn)和早治療對于患者至關(guān)重要[12]。因缺乏明顯的早期癥狀，導(dǎo)致大多數(shù)OSCC病例只能在晚期被診斷出來[13]。組織活檢手段并不適合日常篩查，臨床上非常需要唾液外泌體生物標(biāo)志物這樣的成本效益高、簡單、非侵入性的即時(shí)檢測技術(shù)，從而更方便開展OSCC的早期診斷和預(yù)后跟蹤。

3.1 唾液外泌體中的OSCC相關(guān)標(biāo)記蛋白Winck等[14]首次對OSCC患者和健康個(gè)體唾液外泌體的蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析。在檢測的381個(gè)蛋白中，有8個(gè)蛋白 (A2M、HPA、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH)的表達(dá)在病例組和對照組之間有顯著差異，顯示一些免疫反應(yīng)的過程與OSCC有關(guān)，并提示對外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析有助于輔助醫(yī)生對OSCC患者的早期診斷和預(yù)后判斷。

Zlotogorski-Hurvitz等[15]使用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液外泌體的數(shù)量及體積相較健康個(gè)體有所增加，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液外泌體中CD63的表達(dá)升高而CD9和CD81的表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明，唾液外泌體的形態(tài)改變和表面標(biāo)志物表達(dá)水平具有早期診斷OSCC及OSCC高危人群的潛力。

3.2 唾液外泌體中的OSCC相關(guān)標(biāo)記miRNA唾液外泌體中miRNA作為OSCC生物標(biāo)志物的研究開始得比較早，miR-125、miR-200a和miR-31是近些年比較受關(guān)注的幾種唾液外泌體miRNA，前兩者在OSCC患者的唾液中顯著降低，而miR-31則在OSCC患者唾液中過度表達(dá)，這3種miRNA被廣泛建議潛在用作診斷和監(jiān)測OSCC的發(fā)展[2]。

Gai等[16]對來自O(shè)SCC患者和健康對照者的唾液外泌體中的miRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，OSCC組織中miR-512-3p和miR-412-3p相對于對照組顯著上調(diào)，具有較高的敏感度和特異性，而miR-302b-3p和miR-517b-3p僅在OSCC組織中表達(dá)，提示唾液外泌體中這4種miRNA有作為早期診斷OSCC生物標(biāo)志物的可能。

He等[17]通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，OSCC患者唾液外泌體中miR-24-3p的表達(dá)顯著增加，且具有較高的敏感性和特異性；此外，miR-24-3p的過表達(dá)還促進(jìn)了OSCC細(xì)胞的增殖并調(diào)節(jié)了細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。這提示miR-24-3p有作為OSCC早期診斷指標(biāo)及靶向治療的靶點(diǎn)的潛力。

Mehterov等[18]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p在OSCC患者的唾液外泌體中相較健康個(gè)體顯著下調(diào)，具有較高的敏感性和特異性，表明其具有作為OSCC診斷標(biāo)志物的價(jià)值；研究還發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p的靶基因中有31個(gè)參與p53和Wnt信號(hào)通路，并可以調(diào)控OSCC的生長、轉(zhuǎn)移和放療抗性。

3.3 OSCC的唾液外泌體光譜特征Zlotogorski-Hurvitz等[19]利用傅里葉變換紅外光譜儀觀察到OSCC患者唾液外泌體的核酸內(nèi)磷酸鍵的吸收帶和膜脂帶強(qiáng)度低于健康個(gè)體，而糖原帶、核酸帶和amine Ⅱ膜蛋白強(qiáng)度高于健康個(gè)體，顯示出OSCC唾液外泌體的特定紅外光譜特征。這種方法區(qū)分OSCC和健康個(gè)體具有100%的敏感性和89%的特異性。這表明傅里葉變換紅外光譜儀有應(yīng)用于診斷早期OSCC并監(jiān)測OSCC前病變的風(fēng)險(xiǎn)人群的潛力。此外，因其在早期和晚期OSCC中的結(jié)果不同，也可用于OSCC患者隨訪。

4 唾液外泌體與OPMD

OPMD是一種重要的癌前病變，包括口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)、口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)、口腔紅斑病、口腔黏膜下纖維病變(oral submucous fibrosis, OSMF)等。據(jù)推測，OPMD患者罹患OSCC的風(fēng)險(xiǎn)是普通人的5～100倍[20]。考慮到OPMD的惡性傾向，OPMD患者應(yīng)當(dāng)定期跟蹤病情的進(jìn)展乃至進(jìn)行終生隨訪。相比組織病理活檢和血液檢查，唾液外泌體檢查的非侵入性就體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。

4.1 OLP的唾液外泌體標(biāo)記OLP是以T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常激活的慢性炎癥，表現(xiàn)為基底角質(zhì)細(xì)胞液化變性以及淋巴細(xì)胞的帶狀上皮下浸潤，臨床上可能呈現(xiàn)角化、紅斑和潰瘍性病變等癥狀。目前，WHO已將其定義為癌前病變[21]。據(jù)報(bào)道，相較于健康個(gè)體，OLP患者及OSCC患者的唾液外泌體中miR-21水平升高、miR-125a水平降低，說明這2種改變可能預(yù)示著預(yù)后不良。相反，與健康個(gè)體相比，發(fā)育不良OLP和OSCC患者的miR-31和miR-200a水平顯著增加，但在來自非發(fā)育不良OLP患者的樣本中沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象；相較健康個(gè)體及OLP患者，僅OSCC患者的顯著降低，此結(jié)果提示miR-31和miR-200a水平無顯著變化可能表明病情沒有惡性轉(zhuǎn)化[22]。

4.2 其他OPMD中的外泌體目前關(guān)于OLK、口腔紅斑病、OSMF等唾液外泌體生物標(biāo)志物的獨(dú)立研究比較少見，但是已經(jīng)有關(guān)于OPMD唾液外泌體的復(fù)合研究。Al Rawi等[23]通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)唾液外泌體中的miR-375具有作為OSCC等OPMD的臨床診斷與預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值。

Uma Maheswari等[24]在一項(xiàng)36例OPMD患者(OLK、OLP和OSMF)參與的唾液miR-21和miR-31評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)miR-21 和 miR-31 的上調(diào)在OLK和OLP中顯著，在OSMF和具有OLK的OSMF中最小。OPMD嚴(yán)重發(fā)育不良與對照組相比，唾液miR-21增加了3.6倍，miR-31增加了2.5倍。說明miR-21與嚴(yán)重發(fā)育不良之間存在著明顯關(guān)系，因此在評(píng)估OPMD的極早期惡性變化方面，唾液外泌體中的miR-21比miR-31的潛力更大。

最近有學(xué)者使用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)研究了口腔癌前病變患者及健康個(gè)體唾液中可能來自唾液外泌體的IL-6及其mRNA的水平。Scholtz等[25]發(fā)現(xiàn)，與健康個(gè)體相比，在癌前病變組中檢測到IL-6 mRNA水平升高，表明唾液IL-6 mRNA水平升高可能與口腔中的腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)。

5 結(jié)語與展望

唾液外泌體已經(jīng)體現(xiàn)出比其他液體活檢的顯著優(yōu)勢，不僅僅體現(xiàn)在采樣的方便、無創(chuàng)方面，而且相比傳統(tǒng)唾液診斷的限制，例如污染以及淀粉酶等蛋白質(zhì)的存在可能掩蓋其他低表達(dá)蛋白等，外泌體的高生物穩(wěn)定性、特異性和靈敏性大大增強(qiáng)了唾液外泌體的臨床適用性。唾液外泌體中含有大量的生物分子，這些分子表達(dá)水平的變化可用于疾病的早期篩查診斷、監(jiān)測臨床狀態(tài)、疾病進(jìn)展和治療效果。同時(shí)，外泌體具有攜帶生物分子的功能，有潛力發(fā)展成為臨床藥物傳遞載體。到目前為止，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唾液外泌體可能成為多種口腔惡性病變的生物標(biāo)志物，但是這方面的研究仍然處于非常早期，還有許多空白需要突破。相信隨著唾液外泌體受重視程度的提高以及技術(shù)的成熟和研究的深入，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多特異性和敏感性較高的唾液外泌體生物標(biāo)志物。