褪黑素對小鼠心肺復蘇后腦損傷的影響及其機制研究*

李英，趙暉，王躥躥，南岳，王東，杜新平

（天津市第五中心醫院心血管內科，天津300450）

腦組織缺血再灌注導致的損傷是心臟驟停（cardiac arrest,CA）后死亡的首要病因[1]。然而到目前為止，尚無藥物能有效改善其預后。有研究表明，腦組織缺血再灌注后可導致氧自由基生成、鈣超載、炎癥反應、內質網應激等，并且進一步導致腦神經元細胞死亡[2-3]。褪黑素是由松果體分泌的神經內分泌激素，具有降低氧自由基、抑制內質網應激等作用。多項動物研究結果顯示，褪黑素通過其抗氧化活性可有效減輕腦、腎等器官的缺血/再灌注損傷[4-6]。然而，褪黑素是否能夠通過抑制內質網應激并緩解CA、心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后腦缺血/再灌注損傷尚未見報道。本研究擬復制小鼠CA 后CPR 誘導的腦損傷模型，通過褪黑素藥物干預，探討其作用及作用機制，以期為臨床研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般材料

44 只健康、雄性、成年、體重18～24 g 的BALB/c 小鼠，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2021-0013，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2020-0050，購于常州卡文斯實驗動物有限公司。小鼠隨機分為假手術組（8 只）、模型組（18 只）、褪黑素組（18 只）。動物飼養及實驗方案均嚴格按照醫院動物倫理委員會動物實驗規范執行。

1.2 主要設備與試劑

體視顯微鏡（SANQTID 8-50X） 購自深圳市三鏘泰達光學儀器有限公司，生物信號采集處理系統（MADLAB-4C/501H 型） 購自北京眾實迪創科技發展有限責任公司，呼吸機購自河南省新鄉市原陽縣振華教學儀器有限公司。褪黑素（C10260299）購自上海麥克林生化科技有限公司，肝素（EHJID-HEP001）購自浙江惠嘉生物科技有限公司，氯化鉀（10016308）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，鹽酸腎上腺素（200116）購自寧波第二激素廠，丙二醛（Malondialdehyde,MDA）檢測試劑盒（K739-100）購自美國Biovision 公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性檢測試劑盒（KGT02424）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，兔抗小鼠一抗GRP78（#3177）、Chop（#3177）、PERK（#3192）、eIF2α（#5324）、p-eIF2α（#3398）、ATF4（#11815）、β-actin（#4970）、山羊抗兔二抗（#7074）購自美國Cell Signaling Technology 公司，p-PERK（bs-3330R）購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物準備與模型復制小鼠手術前夜禁食，可自由飲水。術前稱重，使用異氟烷吸入麻醉后氣管插管，接入呼吸機，異氟烷維持濃度為1.5%，吸入氧濃度30%、氮氣70%，固定小鼠，并記錄標準Ⅰ導聯心電圖，將測溫探頭置于顳肌，加溫頭部至37.5℃，并維持10 min。剔除右側胸前區和右腹股溝區鼠毛，先后予以乙醇和絡合碘消毒。消毒后以右側胸鎖關節為中心斜下、右腹股溝沿大腿切開0.7～1.0 cm，分離頸外靜脈、股動脈。于股動脈置入PE10 管，并接入血壓監測系統檢測血壓，于頸外靜脈置入PE10 管（PE 管預充1%肝素鹽水）。PE10 管連接于充有50 μL 1%肝素的注射器。置管后注射25 μL 1%肝素，隨后抽吸300～350 μL 血液。待腦溫達37.5℃后迅速注射30 μ L 0.5 mol/L 氯化鉀，關閉呼吸機、麻醉藥物、氮氣，將氧氣濃度調至100%。心臟驟停2 min 后將先前抽取的血液1 min 內注射進小鼠體內。小鼠心臟驟停7 min 30 s 后緩慢靜脈泵入3.2%腎上腺素（1.2 mL/h）。小鼠心臟驟停8 min 時打開呼吸機，心臟按壓（300 次/min），靜脈快速泵入3.2%腎上腺素100 μL 后繼續以1.2 mL/h 速度持續靜脈泵入。自主循環恢復后停止按壓，繼續靜脈泵入3.2%腎上腺素50 μL，自主循環恢復10 min后將吸入氧氣濃度調整為50%、氮氣濃度調整為50%，30 min 后關閉呼吸機、氧氣、氮氣，并放置于鼠籠恢復。心臟按壓2 min 30 s 尚未恢復自主循環視為復蘇失敗，作為排除標準。實驗整個過程維持腦溫37.5℃。因股動脈穿刺術后小鼠右下肢癱瘓，無法進行行為學檢測，各組選取5 只測定血壓，其余不進行血壓監測。假手術組術前準備同上。待腦溫達到37.5℃、吸入氧濃度調至100%時，不予以注射腎上腺素。待18 min后將吸入氧氣濃度調整為50%、氮氣濃度調整為50%，38 min 后撤股動脈管、縫合皮膚，關閉呼吸機、氧氣、氮氣，置于鼠籠恢復。假手術組不予任何處理。褪黑素組于術前30 min 腹腔注射褪黑素（10 mg/kg），術后第2 天開始以同樣劑量腹腔注射，2 次/d。模型組注射1%乙醇鹽水，注射時間和方式同褪黑素組。

1.3.2 神經功能評分各組小鼠心臟驟停后第3 天進行行為學測定。神經功能評分采用9 分法[7]，具體評分標準如下：將小鼠放置在10 cm×20 cm 的水平網格狀屏幕上（網格大小為0.2 cm×0.2 cm），并旋轉到垂直90°，記錄小鼠能夠黏附在垂直屏幕上的時間，持續≥15 s 計3 分。接下來，將小鼠放在一根水平木棒（直徑1.5 cm）的中心，并記錄小鼠在木棒上保持平衡的時間，持續≥30 s 計3 分。最后進行牽拉試驗，測定小鼠能抓住水平繩子的時間，>5 s 計3 分。9 分為正常，0 分為嚴重神經功能損傷。

1.3.3 小鼠存活率評估心臟驟停后第10 天觀察小鼠的死亡情況，計算存活率。

1.3.4 Western blottingWestern blotting 檢測小鼠腦組織GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、Chop 蛋白相對表達量。心臟驟停后6 h 取各組小鼠全腦，各組剪取適當大小腦組織加入到裂解液中裂解，裂解完后4℃、12 000 r/min離心5 min，采用BCA 法測定蛋白濃度，根據測定結果對蛋白濃度進行調整。取等量蛋白樣品依次進行8% SDSPAGE 電泳和轉膜，隨后室溫搖床封閉2 h。分別加入相應一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，再用二抗（1∶2000）37℃搖床孵育2 h。以β-actin 作為內參，ECL顯色曝光、照相，采用Image J 軟件處理圖像，計算目標蛋白與β-actin 灰度比值。

1.3.5 LDH、MDA測定心臟驟停術后6 h 取動脈血500 μL，靜置后離心取血清，檢測LDH 活性；取10 mg 腦組織，加入1 mL 的MDA 裂解液（已加入3 μL 100×BHT）勻漿，以13 000 r/min 離心10 min，取上清液，測定MDA 水平。樣品制備完成后，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 海馬CA1 區神經元細胞死亡檢測將實驗所需組織放入4%多聚甲醛固定后，用分級濃度的乙醇脫水，二甲苯使其透明化，隨后組織浸蠟、包埋，并切成5 μm 厚的連續切片。切片用蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇浸泡3 s，伊紅復染3 min。最后將切片脫水，并固定于顯微鏡下觀察、拍照，統計神經元細胞死亡情況。

1.4 統計學方法

數據分析采用Prism 5 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用Monte Carlo 近似法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般資料比較

小鼠均復蘇成功。各組小鼠體重、心率、平均動脈壓、胸外按壓時間、腎上腺素用量、自主呼吸恢復時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組小鼠一般資料比較（±s）

表1 各組小鼠一般資料比較（±s）

組別假手術組模型組褪黑素組F/t 值P 值n8 18體重/g 20.1±2.2 21.2±2.2 21.1±2.0 0.818 0.448心率/（次/min）540.0±21.3 544.5±19.1 541.2±15.1 0.192 0.826平均動脈壓/mmHg 76.1±3.2 76.4±4.5 75.1±2.5 0.541 0.586胸外按壓時間/s-87.4±32.1 78.1±25.0 0.940 0.354腎上腺素用量/μL-263.1±39.4 264.3±41.2 0.075 0.941 18自主呼吸恢復時間/s-413.1±68.2 390.2±62.2 1.060 0.296

2.2 褪黑素對小鼠存活率的影響

模型組術后第5、7 及8 天分別死亡1 只，10 d生存率為70%，褪黑素組第9 天死亡1 只，10 d 生存率為90%，假手術組小鼠10 d 內無死亡情況。各組小鼠術后10 d 生存率比較，經Monte Carlo 近似法檢驗，差異無統計學意義（P=0.286）。

2.3 各組神經功能評分比較

假手術組、模型組、褪黑素組神經功能評分分別為（8.91±0.08）分、（4.40±0.97）分、（6.20±0.63）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=115.012，P=0.005），模型組較假手術組低（P<0.05），褪黑素組較模型組高（P<0.05）。表明褪黑素能夠緩解CA 引起的腦神經功能損傷。

2.4 各CA1區神經元細胞死亡數量比較

假手術組、模型組、褪黑素組CA1 區神經元細胞死亡數量分別為（9.05±1.84）個/Hp、（22.11±3.28）個/Hp、（15.35±3.50）個/Hp，經方差分析，差異有統計學意義（F=16.340，P=0.0037），模型組較假手術組多（P<0.05），褪黑素組較模型組少（P<0.05）。見圖1。

2.5 各組LDH活性、MDA水平比較

各組LDH 活性、MDA 水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），模型組較假手術組高（P<0.05），褪黑素組較模型組低（P<0.05）。提示褪黑素能夠緩解CA/CPR 引起的腦神經損傷。見表2。

表2 各組LDH活性、MDA水平比較（±s）

表2 各組LDH活性、MDA水平比較（±s）

組別假手術組模型組褪黑素組F 值P 值LDH活性/（u/L）466.35±32.98 641.63±42.34 519.56±35.55 17.540 0.003 MDA水平/（nmol/mg）3.99±0.40 12.59±0.81 7.39±1.11 82.430 0.000

2.6 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對表達量比較

各組腦組織GRP78、Chop、p-PERK、p-eIF2α、ATF4 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05），模型組較假手術組高（P<0.05），褪黑素組較模型組低（P<0.05）。見表3 和圖2。

圖2 腦組織中內質網應激及其通路相關蛋白的表達

表3 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組腦組織GRP78、Chop、ATF4、p-eIF2α、p-PERK蛋白相對表達量比較（±s）

組別假手術組模型組褪黑素組F 值P 值GRP78 0.26±0.05 0.93±0.04 0.57±0.04 190.400 0.000 Chop 0.37±0.02 0.78±0.03 0.56±0.03 192.500 0.000 ATF4 0.27±0.03 0.77±0.04 0.48±0.02 186.200 0.000 p-eIF2α 0.51±0.03 0.99±0.01 0.83±0.04 184.600 0.000 p-PERK 0.22±0.02 0.72±0.03 0.43±0.03 297.500 0.000

3 討論

目前公認的心臟驟停后腦復蘇最有效的治療策略是腦部低溫治療，但是其療效十分有限。因此，探尋新的、有效的治療方法具有重要意義。本研究結果顯示，褪黑素組神經功能評分及腦海馬CA1 區神經元細胞死亡檢測結果均顯著優于模型組，3 組CA/CPR 后10 d 小鼠存活率比較差異無統計學意義，但褪黑素組小鼠存活率高于模型組，說明褪黑素對CA/CPR 后腦缺血/再灌注損傷有一定的保護作用。

褪黑素是松果體分泌的一種激素，具有高脂溶性，能通過血腦屏障進入神經細胞和神經膠質細胞中發揮作用[8]。多項研究表明，褪黑素具有很強的清除羥自由基和過氧自由基的作用，還可通過增加抗氧化酶的活性發抗氧化作用，是已知體內最強的抗氧化成分之一[9]。目前認為心臟驟停后腦缺血/再灌注損傷主要機制之一是氧化應激反應[10]。有趣的是，內質網應激反應及PERKeIF2α-ATF4 信號通路與活性氧具有緊密的聯系，PERK-eIF2α-ATF4 信號通路參與清除氧自由基而達到抗氧化作用[11-12]。此外，有研究報道褪黑素可有效改善小鼠急性心肌缺血/再灌注損傷，其機制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4 信號通路從而減少細胞凋亡[13]，亦有研究結果顯示褪黑素可通過抑制內質網應激，發揮腦梗死后的腦保護作用[14]。本研究結果顯示，假手術組小鼠大腦GRP78、p-PERK、p-eIF2a、ATF4、Chop 蛋白相對表達量較模型組顯著降低，褪黑素組較模型組降低，說明褪黑素可以抑制內質網應激，減少氧化應激，保護神經。

綜上所述，褪黑素對CA/CPR 后小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。其機制可能是通過抑制PERK-eIF2α-ATF4 信號通路，從而緩解內質網應激，減輕神經損傷。