納米二氧化鈦神經毒性的研究進展*

田雨陽，王旖旎，王宇，馬焜

（哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江哈爾濱150081）

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于1～100 nm，并作為基本單元構成的材料，具有體積效應、表面效應、量子尺寸效應、隧道效應和介電限域效應五大基本特征，由此也導致納米材料在物理和化學方面具有其獨特的性能[1]。近年來隨著納米技術基礎理論和新材料應用的不斷發展，納米材料已經在傳統材料、醫療器材、電子設備的行業得到了廣泛的應用。納米二氧化鈦（titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）又稱鈦白粉，因其具有最佳白度、不透明度、光亮度、黏附能力強、熔點高、較好的抗菌性和紫外線掩蔽作用等特點，現已被廣泛應用于涂料、造紙、印刷、化妝品和醫療等行業[2-3]。由于TiO2NPs 在人們生活中的應用范圍不斷擴大，其暴露機會也不斷增加，其毒性和毒效應也逐漸引起了人們的關注。人們通過食入、吸入、皮膚滲透等途徑長期接觸TiO2NPs 顆粒的頻率大大增高[4]，其可能成為危害人類健康的潛在環境污染物，其生物安全性亟待評估。目前對于TiO2NPs 生物毒性效應的研究主要集中在肺毒性、肝腎毒性、心血管毒性、皮膚毒性、生殖毒性及遺傳突變等，其神經毒性研究仍處于起步階段。本文根據以往的實驗研究進展，結合國內外相關文獻，總結TiO2NPs 的神經毒性及作用機制，探討其對神經系統的潛在影響并做出展望，為TiO2NPs 在各領域中的安全應用提供參考。

1 TiO2 NPs的理化性質

TiO2NPs 是白色固體或粉末狀物質，分子量79.9 Da，熔點高，主要包括銳鈦礦型（Anatase，簡稱A 型）和金紅石型（Rutile，簡稱R 型）等晶型[5-6]。TiO2NPs 直徑<100 nm，具有很高的熱穩定性、親水性和化學穩定性，此外，還具有高折光性和高光活性，因此它既可吸收紫外線，也可反射、散射紫外線，有非常強的紫外線屏蔽作用。由于其具有納米材料的基本特性，TiO2NPs 的某些物理化學性質與原型和微米TiO2均有所不同，納米級的粒徑使TiO2NPs 具有較大的表面積和較強的吸附能力[7]。通常TiO2NPs 被認為是無毒物質，但由于TiO2NPs 具有納米材料的獨特性質，仍可對生物體造成潛在危害。

2 TiO2 NPs進入中樞神經系統的途徑

腦組織對外界刺激十分敏感，而且缺乏有效的防御機制，即使是進入微量的外界物質，都極易誘發神經系統應激反應，造成神經元損害和中樞神經系統的功能紊亂。因此，闡明TiO2NPs 對中樞神經系統的損傷機制迫在眉睫。粒徑極小的TiO2NPs可以避開免疫系統的吞噬作用，主要經由呼吸道、胃腸道和皮膚滲透3 種方式進入血液系統，通過血腦屏障或鼻-腦通路沉積在腦組織或隨血液循環到達中樞神經系統。進入中樞神經系統的TiO2NPs可破壞血腦屏障和神經細胞間的緊密連接，引起血腦屏障功能障礙和腦組織微環境的改變，從而導致中樞神經系統的功能性病變[8]。

2.1 胃腸道途徑

TiO2NPs 具有的最佳白度特性使其作為白色素食品添加劑廣泛用于各種食品著色。歐盟將其列為食品著色劑、食品添加劑、飲食輔料或用于食品包裝。巧克力、口香糖、果凍、膨化食品、油炸食品和固體飲料中都含有高劑量的TiO2NPs，每單位含鈦可達到0.01～1.00 mg，其中TiO2NPs顆粒含量達到27.7%～43.7%，并且95%在咀嚼時非常容易進入人體，胃腸道中的TiO2NPs 濃度可在24 h 內達到200 g/mL。根據最近數據表明，10 歲以下兒童和其他人群的膳食中TiO2NPs 的人體暴露量分別達到1～2 mg/（kg·d）和0.2～0.7 mg/（kg·d）[9]。因此經胃腸道成為了主要的暴露途徑之一。經胃腸道攝入的TiO2NPs 直接被小腸和大腸的淋巴組織吸收，轉到腸系膜進入血液循環，透過或破壞血腦屏障進入中樞神經系統。經胃腸道攝入TiO2NPs 吸收后容易通過腎臟排泄，腦部積累量較低，呈現TiO2NPs 粒徑越大，腦內蓄積含量越高的趨勢。

由于腹膜面積大，血管和淋巴管豐富，吸收能力強，藥劑注射后可被迅速吸收，因此腹腔注射被當作為一種常用的給藥方法。劉青等[10]給小鼠一次性腹腔注射不同劑量的TiO2NPs 顆粒溶液，14 d 后進行測定，結果小鼠肺及腦組織中的抗氧化酶和丙二醛濃度出現變化，說明TiO2NPs 對肝臟、腦和肺組織有一定損害作用,且不同組織器官的損傷程度不同。GERAETS 等[11]將5 種二氧化鈦納米顆粒（100 nm、101 nm、102 nm、103 nm 和104 nm）給予大鼠口服，并選擇肝臟、脾臟和腸系膜淋巴結作為鈦分析的目標組織，結果發現肝和脾中的鈦水平僅在某些大鼠中高于檢測極限，腸系膜淋巴結中含量較低，表明TiO2NPs 在胃腸道中的吸收非常有限。經腸上皮細胞吸收的TiO2NPs 進入循環系統，在與相應蛋白質結合的過程中也可導致相關蛋白數目的增多[12]，后者也可能影響TiO2NPs 在人體內的分布。

2.2 呼吸道途徑

TiO2NPs 因其催化作用和特殊的光效應而常被用于光涂料和漆料等領域，這也導致其可經呼吸道進入人體[13]。TiO2NPs 光催化消毒機和TiO2NPs噴液可用于空氣凈化、殺菌消毒或清除有機物污染時，空氣中的TiO2NPs濃度可增加到0.7～16.0 μg/L[14]，大氣中殘存的TiO2NPs 可通過呼吸道吸入體內；化工行業在制造氧化鈦過程中，職業人群長期暴露于含TiO2NPs的空氣中，在其鼻咽、支氣管和肺部可有明顯的沉積，并且可通過嗅球轉移到腦[15]。呼吸道是TiO2NPs進入機體的主要途徑，其可由鼻咽部進入呼吸系統，穿透呼吸道表皮細胞進入細胞質，隨后直接進入血液循環系統或間接經過淋巴系統分布全身，穿過血腦屏障進入中樞；或穿過鼻黏膜被嗅覺神經和感覺神經末梢攝取，進入嗅球沿神經轉運入腦[16]。由于粒徑較小，生物活性較高，所以可以以簡單擴散等形式通過氣-血屏障，沉積在肺泡組織和毛細血管處。OBERDORSTER 等[15]使用粒徑為20 nm 和200 nm 的TiO2NPs 對大鼠進行亞慢性吸入實驗，結果兩組大鼠的下呼吸道均有TiO2NPs 沉積，且20 nm組的沉積時間更長，引起的炎癥反應也更嚴重，說明粒徑大小可影響沉積和損害程度。此外，TiO2NPs 也可經嗅神經轉移進入腦部并蓄積。ZHANG等[16]將雌性小鼠每隔1 天鼻內滴注4 種不同類型的TiO2NPs 顆粒，每次30 d，結果發現鼻內滴注親水性TiO2NPs 后，小鼠大腦皮層和紋狀體中鈦含量顯著增加，大腦皮層神經元發生顯著變化。

2.3 皮膚途徑

由于TiO2NPs 具有優異的穩定性、低腐蝕性和抗紫外線等特點，被廣泛用于化妝品[17]。將TiO2NPs 作為防曬成分添加到防曬霜中，可有效提高防曬指數，降低紫外線對皮膚的刺激作用，TiO2NPs可經皮吸收蓄積到角質層和表皮[18]。經皮膚接觸的TiO2NPs 可能以滲透形式沉積在皮膚角質層和真皮層，TiO2NPs 可被皮膚局部淋巴結或被真皮層的感覺神經末梢攝取，并沿神經轉運至中樞。但目前TiO2NPs 是否可以經過皮膚進入人體并造成損害尚不確定。TiO2NPs 曾普遍被認為只會沉積在角質層最外層，不會滲入深層皮膚。但仍有少數實驗證實TiO2NPs 可滲透入深層皮膚。WU 等[19]在豬耳上局部施用30 d 的TiO2NPs，發現其可以穿透角質層并到達表皮深層；同時無毛小鼠皮膚在接觸TiO2NPs 60 d 后，TiO2NPs 可穿透皮膚到達不同組織，并誘發多種病理性病變。

3 TiO2 NPs的神經毒性

近年來，許多研究證實TiO2NPs 可透過肺血屏障、血腦屏障、血睪屏障、胎盤屏障等生物屏障，進入肺、腦、腎、肝等臟器，影響其生物學功能。TiO2NPs 因其特殊的物理化學特性和生物學惰性，具有強大的組織細胞穿透能力、氧化能力和催化能力。大鼠經口灌胃或鼻腔滴注方式進行TiO2NPs 染毒后，TiO2NPs 進入大鼠腦組織后可增強嗅球和海馬等區域氧化應激反應，抑制神經遞質的釋放，減弱大鼠的空間記憶能力和學習能力[20]。此外，在妊娠期小鼠腹腔注射TiO2NPs，會在胎盤子代大鼠的肝臟和腦內出現，而非納米級的TiO2顆粒并未引起這些癥狀。腦組織對外界刺激十分敏感，而且缺乏有效的防御機制，TiO2NPs 可損傷血腦屏障細胞和神經細胞間的緊密連接，引發血腦屏障功能障礙和腦組織微環境的改變，導致中樞神經系統的功能性改變。TiO2NPs 在腦內蓄積可引起神經毒性，主要通過誘發炎癥反應、氧化應激、神經細胞凋亡和信號通路的異常激活導致中樞神經系統功能紊亂，但具體機制尚未明確。大量的動物和細胞實驗證明TiO2NPs 顆粒對中樞神經系統具有潛在的神經毒性[21]。

3.1 中樞神經遞質紊亂

TiO2NPs 可以改變血腦屏障的通透性，使腦內多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺及乙酰膽堿等神經遞質的分泌水平和代謝酶活性明顯下降；紋狀體、黑質及海馬區鈦含量顯著升高；神經元出現空泡、變性和死亡，神經膠質細胞異常增殖，組織出血和壞死等[22]。

3.2 氧化應激

目前，已有許多研究表明TiO2NPs 可對人體和其他生物產生明顯的神經毒性作用，并影響相應神經功能、學習能力。TiO2NPs 蓄積會激活神經細胞內的氧化應激反應，活性氧（reactive oxygen species,ROS）和脂質過氧化物大量釋放，破壞生物膜脂質、蛋白質和DNA 等大分子物質，導致線粒體和泛素-蛋白酶體系統的功能障礙，神經元內α-突觸核蛋白（α-synuclein,α-syn）異常聚集，抑制神經細胞增殖，發生細胞周期阻滯和細胞凋亡[23]。郭晴等[17]將56 只小鼠經皮膚暴露途徑連續42 d 暴露在8 組不同劑量的TiO2NPs 中，結果表明TiO2NPs可以經皮膚進入血液，并通過血腦屏障對大腦造成損傷。COCCINI 等[24]的研究證實短期暴露于低劑量（0.1～1.5 mg/mL）的TiO2NPs 即可對人腦SH-SY5Y細胞和D384 細胞系造成損害。LIU 等[18]通過測試不同大小的TiO2NPs 在體內外對大鼠星形膠質細胞存活率的抑制作用，發現TiO2NPs 可導致細胞形態結構發生明顯變化，腦組織發生壞死。HU 等[25]發現TiO2NPs 可能在斑馬魚幼蟲的大腦中積累，引起體內和體外多巴胺能神經元的丟失，對帕金森病的發生具有潛在影響。TiO2NPs 也可沉積在生物的海馬體部，對學習和記憶能力造成影響。盛蕾[22]以具有發育特性的大鼠原代海馬神經元細胞作為模型，用不同濃度（5 μg/mL、15 μg/mL 和30 μg/mL）的TiO2NPs（銳鈦型，5 nm）處理細胞24 h，TiO2NPs 可以抑制原代海馬神經元細胞質和細胞核，抑制樹突發育。王文斌[21]將50 只SPF 級健康雄性大鼠分為5 組，分別以蒸餾水，62.5 mg/kg、125 mg/kg、250 mg/kg TiO2NPs 和250 mg/kg普通粒徑TiO2進行灌胃染毒，在實驗結束前6 d，利用Morris 水迷宮測定大鼠的學習記憶能力，并在實驗結束時每組隨機選2 只大鼠做常規病理切片，結果發現TiO2NPs 可進入大鼠血液及海馬組織中并產生蓄積，并使大鼠空間學習記憶能力下降，造成大鼠腦皮層和海馬組織損傷，誘導大鼠腦皮層和海馬組織神經細胞凋亡。PEREZ-ARIZTI 等[2]用H2DCFDA 氧化法研究TiO2NPs 顆粒對大鼠星形膠質細胞的強氧化應激作用，流式細胞分析儀顯示，與未暴露的細胞比較，ROS 在短時間（2 h、4 h 和6 h）內增加，而在TiO2NPs 暴露24 h 和48 h 后，ROS 的增加量更多。HE 等[26]發現抗氧化劑N-乙酰基-L-半胱氨酸可顯著降低小鼠海馬神經元HT22 細胞中TiO2NPs 誘導的內質網應激，其特征在于葡萄糖調節蛋白78（GRP78）的下調和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）的裂解，表明氧化應激參與了TiO2NPs 誘導的內質網應激。KRAWCZYNSKA 等[27]發現TiO2NPs 可以降低芳香化酶基因的表達，降低谷胱甘肽過氧化物酶和還原酶的活性，產生氧化應激。VALENTINI 等[28]通過使用靶向脂質過氧化的抗4-羥基壬醛抗體進行評估，發現海馬體、小腦和室管膜下區域是TiO2NPs 重要的氧化應激部位。見表1。

表1 TiO2 NPs引起的腦組織氧化應激反應致神經毒性

3.3 炎癥反應

炎癥反應是TiO2NPs 引起神經毒性的主要機制之一。TiO2NPs 可誘發中樞免疫調節，刺激TNF-α、白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白細胞介素-1β等炎癥介質的釋放，上調趨化因子如主要組織相容性復合體、單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎癥蛋白-2等表達，加速誘導神經細胞凋亡[21]。GRISSA等[29]每天對大鼠灌胃50 mg/（kg·BW）、100 mg/（kg·BW）和200 mg/（kg·BW）銳鈦礦型TiO2NP（5～10 nm）60 d后，通過評估大腦的系數、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性、IL-6 和神經膠質纖維酸性蛋白的表達以量化腦損傷，結果表明，與對照相比，高劑量銳鈦礦型TiO2NPs 可以導致AChE 活性下調，血漿IL-6 水平升高，誘導神經損傷。SHIN 等[30]對經脂多糖處理30 min 后的雄性C57BL/6 小鼠腹膜內注射超細（21 nm）TiO2NPs，結果顯示小膠質細胞活性增加，促炎細胞因子IL-1 和TNF-α 的mRNA 和蛋白水平顯著提高，表明TiO2NPs 可通過增強小膠質細胞活化來促進神經炎癥反應。除此之外，TiO2NPs 在進入中樞神經系統之后，還可對血腦屏障造成損傷，使血液中的分子和物質經通透性改變的血管壁進入腦組織，促進炎癥發生。

3.4 細胞凋亡

LIU 等[31]將PC12 細胞分別暴露于TiO2NPs（10 g/mL 和50 g/mL）24 h 后，通過流式細胞術檢測PC12 細胞的凋亡，結果TiO2NPs 以劑量依賴的方式誘導PC12 細胞的凋亡，但用ROS 清除劑預處理可以抑制TiO2NPs 誘導的PC12 細胞的凋亡，說明TiO2NPs 是通過氧化應激的方式引起細胞凋亡。TiO2NPs 誘導神經炎癥信號，激活炎癥級聯反應和絲裂原活化蛋白激酶、蛋白酪氨酸激酶及P53 等信號通路， 誘導凋亡相關基因NF- κB、Bax、Caspase-3等異常表達[32-33]。WU 等[34]和冒志磊[35]將PC12 細胞暴露于TiO2NPs 顆粒中，通過Western blotting 和Caspase 3 對c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、P53、P21、Bax 和Bcl-2 進行分析，結果表明TiO2NPs 可通過ROS 和JNK/P53 介導的凋亡作用誘導神經元損傷，并通過激活P53/P21 途徑引起細胞在G2/M 期發生阻滯。

4 結論

TiO2NPs 作為最有潛力的新型納米材料之一，在生活的各個方面逐漸得到了廣泛的應用，并且有著可觀的發展前景。TiO2 NPs 對人體可能具有潛在的遺傳毒性和神經毒性，其中神經毒性主要表現為海馬體受損，小腦病變等引起的學習、記憶能力減退和阿爾茲海默病。TiO2NPs 誘導的神經毒性會加重腦內的免疫炎癥反應和氧化應激，破壞血腦屏障的完整性，損傷腦內神經元，引起中樞神經系統損傷。然而，現有的實驗結果和證據均不能證明TiO2NPs 會對人體產生嚴重影響，由于缺乏可靠的生物安全模型，同時其物理化學性質和引起影響的強弱與粒徑大小和顆粒數目有很大關系，TiO2NPs的生物安全性值得進一步研究和討論。隨著TiO2NPs 應用的加快，對其進行安全性評價的需求也迫在眉睫，從而為生命健康提供保障，為材料正確合理使用提供依據。