三維電鏡在腦干耳蝸核神經元形態學研究中的應用

周佳蕾，盛海斌，王皓煜，魯 巖，王方方，吳 皓1，2，，華云峰1，2，#

1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200011；2.上海交通大學醫學院耳科學研究所，上海市耳鼻疾病轉化醫學重點實驗室，上海 200125；3.上海精準醫學研究院，上海 200125；4.上海交通大學醫學院附屬兒童醫院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200062

耳蝸核（cochlear nucleus，CN）是哺乳動物聽覺中樞的最低級核團，其對稱分布于腦橋和延髓交界處，接受同側耳蝸聽神經投射。既往研究［1］發現，CN 神經元的軸突亦可投射到同側及對側的上橄欖核復合體（superior olivary complex，SOC）。因此，除能夠對來自耳蝸的聽覺信號作簡單中繼外，CN 還可作為雙耳信號處理的起始核團，在聲源定位、雙耳增益校準及回聲抑制等雙耳功能中發揮重要作用。

連接耳蝸聽覺毛細胞的聽神經束在進入CN 后會形成分叉，分別投射至CN 的3 個亞區，即前腹側耳蝸核（anteroventral cochlear nucleus，AVCN）、后腹側耳蝸核（posteroventral cochlear nucleus，PVCN）以及背側耳蝸核（dorsal cochlear nucleus，DCN）。研究［2-3］顯示，位于AVCN 中的叢細胞（bushy cell，BC）是耳蝸聽神經的主要支配對象之一，其胞體可與聽神經形成根蕾狀（endbulb of Held）突觸。且相關研究［4-6］發現，根蕾狀突觸可能賦予了叢細胞與聽神經放電產生鎖相的特征，從而被認為是一種重合檢測器，用于判斷叢細胞上多個聽覺信號間的相關性。同時，相鄰叢細胞可形成具有同步放電特性的細胞簇［7-9］，通過聽神經上連體的根蕾狀突觸或叢細胞間的電耦合來實現相鄰叢細胞的同步放電。此外，叢細胞還可接收來自AVCN 內部衛星細胞及來自同側DCN、對側CN、SOC 和體感神經的直接或間接投射的調控［1，7，10-13］，而完整的投射至叢細胞的神經突觸支配模式及特異性有待進一步明確。另有動物實驗［5，14-15］發現，耳聾以及異常的聽覺經歷均可導致腹側耳蝸核（ventral cochlear nucleus，VCN）發生突觸可塑性變化，而這些改變對VCN 神經環路產生的具體影響尚不清晰。

研究［16］顯示，腦組織神經環路的解析需要足夠的尺度及必要的分辨率，才能獲得單個突觸分辨率的完整神經連接圖譜。但目前，針對CN 神經環路的結構學研究方法僅局限在稀疏熒光標記和光學顯微成像，由于其分辨率的限制，只能行孤立神經元的重構和分析。而孤立重構的神經元雖可用于形態分類和功能預測，但對明確神經環路中同類神經元的分工以及最小功能微環路的組成貢獻較為有限。近年來，三維電鏡技術在通量上的提升使得大尺度、高分辨重構生物樣品成為可能，該新技術已逐漸用于各類腦組織和感官器官的神經連接組學研究［17-19］。基于前期對大腦皮層［20-21］和耳蝸神經組織［22-24］的三維電鏡研究基礎，本課題組擬制備小鼠完整CN 的電鏡樣品，通過X 射線顯微鏡和連續切片三維掃描電鏡對VCN 神經環路進行跨尺度的形態學研究嘗試，為系統開展CN神經連接組學研究奠定基礎。

1 對象和方法

1.1 實驗動物

7～8周齡SPF級正常聽力的雄性CBA/Ca小鼠5只［購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK（滬）2017-0012］，體質量為200～250 g。小鼠飼養于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心的標準飼養籠中，實驗動物使用許可證：SYXK（滬）2016-0016。溫度約25 ℃、濕度60%～70%、12 h 光照與黑暗交替條件下，自由進食、飲水。本研究涉及的動物實驗通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物倫理委員會審批（審批號：SH9H-2021-A728-1），所有動物的相關操作均遵循《實驗動物管理條例》。

1.2 CN的固定和取材

小鼠經腹腔注射水合氯醛（500 mg/kg）進行麻醉后，用微量注射泵（以9 mL/min 的泵速）經心臟先后泵入15 mL 二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）和30 mL 混合固定液（2%多聚甲醛、2.5%戊二醛及0.08 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液，pH=7.4）行全身固定。隨后，處死小鼠并進行斷頭，快速地從其顱骨中解剖、分離出腦組織（需注意在分離腦組織時，應使用精細眼科剪切斷內聽道至腦干間的聽神經，以免破壞CN組織的結構），并浸沒在混合固定液中，于4 ℃下靜置24～48 h。取出腦組織后，將其轉移至裝有二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）的解剖皿中（冰上）。于解剖顯微鏡下小心剔除部分小腦，暴露出腦干及其表面的CN。最終，從腦干中完整分離出CN。

1.3 CN樣品的重金屬塊染

參照已建立的電鏡樣品制備流程中的染色方法［20］對采集的CN 樣品進行染色，具體步驟如下：①使用二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）清洗CN 樣品2 次，每次30 min；隨后，依次于鋨酸（2%）、亞鐵氰化鉀（2.5%）、鋨酸（2%）中分別浸沒2、1.5、1 h。②使用二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）和去離子純凈水清洗樣品各1 次，每次30 min；再將樣品轉移至硫代甲肼（1%水溶液）和鋨酸（2%水溶液）中浸泡1、1.5 h，并于每步之后用去離子純凈水清洗2次，每次30 min。③將樣品浸沒在乙酸鈾（1%水溶液）中，于4 ℃過夜；次日轉移至50 ℃烘箱中靜置2 h，并用去離子純凈水清洗2 次，每次30 min。④再將樣品轉移到新鮮配制的天門冬氨酸鉛溶液（0.03 mol/L）中，于50 ℃浸泡2 h，用去離子純凈水清洗2 次，每次30 min。

1.4 CN核樣品的脫水和樹脂包埋

采用梯度乙醇（50%、75%、90%和100%）及無水丙酮對上述已完成染色的CN 樣品進行脫水，具體如下：①樣品于預冷（4 ℃）的50%、75%、90%乙醇中脫水，每個梯度浸泡30 min。②將樣品轉移至100%乙醇中，于室溫脫水30 min。③于室溫下用無水丙酮脫水3次，每次45 min。

將脫水后的樣品浸沒于無水丙酮與低黏度Spurr樹脂的混合液（體積比1∶1）中，于旋轉儀上（轉速為5 r/s）過夜混勻（離心管蓋保持打開，以便丙酮揮發）。次日，將樣品轉移至純樹脂中靜置8～12 h（離心管關蓋），而后再置于模具中，70 ℃烘箱（需預熱）內高溫聚合72 h以上，完成包埋。

1.5 CN 樣品的X 射線顯微成像及其目標區域的定位和修樣

利用TRIM2 修塊機（Leica，美國）將脫水、包埋后的CN 樣品修成橫斷面約為2.0 mm×2.0 mm 的長方體，并用強力膠將其固定于鋁釘底座上，通過X射線顯微鏡進行掃描、成像。使用圖像處理軟件Dragonfly（Objective Research Systems，加拿大）對獲得的圖像進行三維重構，實現三維體積數據的可視化，用于對樣品染色效果和均一度的初步評估以及CN目標區域的定位。

使用修塊機去除CN 目標區域周圍多余的樹脂，利用UC7 超薄切片機（Leica，德國）對其表面進行拋光處理，再用Ted Pella-208C 離子濺射儀（Ted Pella，美國）對其做噴碳（厚度10 nm）處理后，用Gemini300 掃描電鏡（Zeiss，德國）進行低分辨率快速預掃描（像素為1.59 μm，駐留時間為1.0 μs），用于和X射線顯微成像后重構的圖像進行比對，確定樣品表面在CN的具體位置。

1.6 目標區域的三維電鏡圖像采集、三維重構和超微結構分析

將預掃的電鏡圖像與X射線顯微成像后重構的三維圖像進行結構比對，進一步確定目標區域（VCN的叢細胞簇區域）位置，必要時可通過超薄切片機進行再次修樣，原則上樣品橫斷面大小不大于600 μm×600 μm。而后，利用EM ACE600 高真空鍍膜儀（Leica，德國）對修樣拋光后的CN 樣品表面行真空噴金處理（厚度30 nm），采用連續切片掃描電鏡——Gemini300 場發射掃描電鏡（Zeiss，德國）［內置了3ViewXP 超薄切片機（Gatan，美國）和Onpont背散射電子探測器（Gatan，美國）］對VCN 目標區域進行三維圖像采集。

利用本課題組編寫的MATLAB（Mathworks，美國）腳本對連續切片掃描電鏡采集的原始圖像的對比度與亮度進行匹配、三維對齊重構，并將數據集上傳至開源圖像標記工具WEBKNOSSOS以實現在線瀏覽和標記［25］，包括對叢細胞樹突的追蹤標記以及支配于叢細胞胞體表面各類神經末梢突觸的體積標記。所標記的結構的三維可視化和量化均使用MATLAB 腳本完成。

2 結果

2.1 CN樣品的顯微觀察及其三維成像信息

在解剖顯微鏡下觀察到，小鼠CN 位于腦橋和延髓交界處的兩側，呈現橢圓狀隆起，其長軸自前下方至后上方依次為VCN 和DCN，而AVCN 和PVCN 分別位于耳蝸聽神經殘端的前背側和后背側區（圖1）。通過進一步解剖分離，我們獲得了包括完整CN 在內的腦干組織，尺寸約為2.0 mm×2.0 mm×3.0 mm。最終，共制備了5 個CN 樣品用于后續的成像分析，X射線顯微鏡及連續切片掃描電鏡三維成像信息見表1。

圖1 顯微鏡下觀察小鼠CN的解剖位置Fig 1 Observation of anatomical location of CN in mice under microscope

表1 小鼠CN樣品的三維成像信息Tab 1 Three-dimensional imaging information of mouse CN samples

2.2 CN樣品的X射線顯微圖像及其解剖分區

采用X 射線顯微鏡對CN 樣品進行斷層掃描，對所得圖像進行三維重構，得到具有細胞分辨率的CN三維圖像。CN 樣品尺寸為1.3 mm×1.5 mm×2.6 mm、體素0.7 μm。根據聽神經的特征分布和細胞密度，我們對CN 樣品的各個亞區進行了劃分，其中VCN、DCN 以及聽神經（auditory nerve，AN）的空間分布如圖2A 所示。從樣品的矢狀面（圖2B）和冠狀面（圖2C）來看，聽神經主干和CN 神經元胞體清晰可見；相比于其神經氈，由髓鞘包裹的聽神經束經鋨酸染色后呈現出較高的染色密度（即亮信號），而細胞胞體的染色密度相對較低（即暗信號），且樣品的解剖分區清晰可辨：AVCN 位于聽神經束較短的分支處，PVCN 位于長分支的起始端；而DCN 則位于長分支的末端，與PVCN由細胞密度較低的顆粒細胞亞區間隔。

圖2 CN樣品的X射線顯微成像Fig 2 X-ray microscopic imaging of CN samples

2.3 X射線顯微圖像和掃描電鏡圖像的結構比對

在正式采集連續切片掃描電鏡的數據之前，本研究將修樣后CN 樣品表面的電鏡預掃描圖像與已采集的X射線顯微成像圖像進行比對，結果顯示，樣品表面的電鏡預掃描圖像（圖3A）與X 射線顯微成像的相應層面圖像（圖3B）在特征結構上（胞體及聽神經的特征分布）可完全吻合。繼而說明，通過X射線顯微成像可精確定位目標區域；同時，在其引導下可進一步優化連續切片掃描電鏡采集的目標區域（VCN的叢細胞簇區域）。

2.4 VCN叢細胞及根蕾狀突觸的三維重構

采用連續切片掃描電鏡采集并三維重構的VCN 叢細胞簇區域的高分辨三維圖像數據集（圖4A），所 采集的CN 體積為114.3 μm×105.0 μm×105.0 μm，三維分辨率為10 nm×10 nm×50 nm。在此成像條件下，突觸的特征結構（包括神經遞質囊泡、突觸后致密物）清晰可辨（圖4B），可作為突觸識別的依據。隨后，對叢細胞的樹突結構進行追蹤標記，結果（圖4C）顯示叢細胞有1 個樹突，樹突末端有豐富的分支，與文獻［7］報道相一致。從叢細胞胞體上各類突觸的體積標記（圖4C、4D）和三維重構（圖4E、4F）來看，該細胞胞體受5 個大小相當的根蕾狀突觸支配，共形成了348 個獨立的突觸活躍區（active zone）；此外，其還受來自59 個非聽神經來源的神經末梢的97 個突觸支配。

圖4 VCN叢細胞簇的三維電鏡圖像數據集及相關神經結構的標記與重構Fig 4 Labeling and reconstruction of three-dimensional electron microscopic image dataset of VCN bushy cell cluster and related neural structures

3 討論

聽覺系統具有持續、高頻、高保真傳遞信號的特點，這與一系列具有特殊結構和生理功能的突觸緊密相關，其中包括耳蝸帶狀突觸、CN 根蕾狀突觸以及斜方體內側核（medial nucleus of the trapezoid body，MNTB）的花萼狀巨突觸（calyx of Held），因此對各類聽覺突觸的超微結構及電生理特性的研究對理解突觸傳遞的機制具有重要的意義。對于聽覺突觸超微結構的研究，既往主要是通過透射電鏡對手動收集的連續超薄切片進行成像及重構。由于受到切片質量和穩定性的影響，其重構體積（如厚度）非常有限，常常僅有1～2 個完整細胞。近年來，高通量三維電鏡技術的發展大大提高了神經組織三維圖像采集的效率，已在不同腦組織神經連接組學的研究中得到了越來越多的應用。如：SCHMIDT 等［26］利用三維電鏡成像量化分析大鼠內側嗅皮層中局部單個軸突的突觸前突觸類別，揭示了軸突徑路長度依賴的突觸分類現象；KARIMI 等［27］利用三維電鏡成像量化小鼠大腦皮層不同層梭形細胞頂樹突接受不同類型突觸的獨特輸入圖譜，揭示不同梭形細胞在其頂樹突上所接受調控的神經連接組學規則；GOUR 等［21］利用三維電鏡成像量化并揭示發育過程中小鼠體感皮層抑制性中間神經元突觸產生的環路模式。同時，在神經環路超微結構的解析方面，光學成像的空間分辨率有限，電生理記錄局限于單個腦組織切片中的少量連接，傳統電鏡則受限于成像尺寸；而高通量三維電鏡成像具備大尺寸、高分辨率以及可三維成像等優勢，可以獲得樹突徑路上不同部位和不同類別的突觸密度、軸突徑路上所形成的突觸分布圖譜以及神經元內細胞器結構等超微結構的定量信息，因而能達到光學成像、電生理記錄以及傳統電鏡等成像手段無法實現的目的。在聽覺系統研究領域，三維電鏡也越來越多地被應用于耳蝸毛細胞和NMTB 中花萼狀巨突觸的形態及發育研究［28-31］，但將其應用于CN 的研究尚未有報道，其瓶頸之一即為相關組織電鏡樣品的制備。而本研究在前期工作［20］的基礎上，首次實現了小鼠完整CN 三維電鏡樣品的制備，相比之前的工作其具有更大的體積以及組織的特異性。同時，本研究利用X射線顯微成像，對其染色效果進行評估并對其目標區域進行初步定位；成功采集了VCN 叢細胞簇區域的三維電鏡圖像，并在突觸分辨率下實現了VCN 中叢細胞及其表面的根狀蕾突觸和非聽神經來源突觸的追蹤和重構。因此，本研究不僅證實了對小鼠CN 開展三維電鏡研究的可行性，還提供了具體的實驗細節，包括CN 樣品的制備流程、X 射線顯微成像輔助的目標區域定位以及三維電鏡的成像條件。

作為VCN 的主神經元，叢細胞可通過根蕾狀突觸接受來自耳蝸聽神經的信號，然而具有不同自發放電速率以及蛋白表達的耳蝸聽神經在叢細胞上的整合方式目前仍不明確［8，32-33］。當外周聽力受到損傷，叢細胞上的根蕾狀突觸會發生一系列顯著的結構改變并伴隨有突觸支配力度的下降，而這樣的改變是否具有聽神經亞型的特異性、如何影響叢細胞對聽覺信號的響應等有待深入的探索分析。已有證據表明，在成年正常聽力以及老年性聾的小鼠CN叢細胞上，特異表達鈣視網膜蛋白（calretinin）和非表達該蛋白的聽神經可支配不同的叢細胞，但后者的占比在老年性聾小鼠中有大幅下降［34］。而在本研究中，我們對叢細胞的三維電鏡重構不僅可以提供更具體的量化指標，包括單個叢細胞上根蕾狀突觸和活躍區的數量以及非聽神經來源的突觸支配信息，同時其更大的重構體積還可以將突觸的量化擴展到叢細胞的樹突結構或是可在叢細胞簇層面上開展進一步的研究。未來，如能將其他研究手段（如免疫金染色等）與三維電鏡成像技術結合，將有望回答更多的關于CN神經環路的未解之疑。

耳鳴、耳聾、異常的聽覺經歷常伴隨有CN 突觸可塑性的改變［35-38］。利用三維電鏡量化這一改變并在神經環路層面揭示其對聽功能的影響，將有助于對相關疾病病理機制的研究。目前，對于因耳蝸嚴重畸形或蝸神經發育不良而無法接受人工耳蝸植入的患者，聽性腦干植入是聽覺重建的唯一手段［39］，即可通過植入電極直接刺激CN 組織產生人工聽覺。由于當前研究者們對相關神經環路的結構、聽神經損傷后引起的CN 神經環路可塑性改變等都缺少足夠的認識，使得精準刺激CN 神經元、對聲信號進行有效編碼的能力極為有限。但隨著三維電鏡技術的不斷發展，其或將推動CN 神經環路的相關研究，從而填補這一空白。