PCI 對RelA的影響及血運重建后的作用機制研究

曹培東，桂 春

（廣西醫科大學第一附屬醫院心內一科，廣西 南寧 530021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis）是一種以強烈的免疫活性為特征的炎癥性疾病，經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是臨床上最常見的治療動脈粥樣硬化性狹窄的方法。隨著對該病認識的加深，選擇性免疫調節干預可能是抗動脈粥樣硬化治療的新方向，然而血運重建后的免疫調節的相關機制尚未明確。RelA 又稱NF-κB3、MGC131774 和p65，是NF-κB 家族的5 個成員之一。NF-κB 轉錄因子家族作為連接免疫和炎癥的中心介質，是先天和后天免疫反應的關鍵參與者[1]。其中，RelA 轉錄因子對調節T 細胞活化和穩定至關重要[2]。本研究旨在驗證PCI 對RelA 水平的影響，分析血運重建后RelA 可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019-2021 年廣西醫科大學第一附屬醫院收治的冠狀動脈狹窄≥90%的14 例動脈粥樣硬化患者冠脈支架植入術前和術后的血清樣本，患者均無心梗、中風、糖尿病病史。人磷酸化核轉錄因子p65（pNF-KB P65）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒從上海酶聯生物科技有限公司購買。人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMCs）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。RelA-RNAi 慢病毒及陰性對照病毒購買于上海吉凱基因。

1.2 ELISA 檢測及篩選目的基因 采用Elisa 法檢測術前和術后血清中RelA的水平，每例重復3 次。芯片數據GSE28829 來自開放數據庫GEO，包含13 個早期和16 個晚期頸動脈粥樣硬化斑塊樣本。利用GEO2R分析GSE28829，選擇校正后P＜0.05 和|logFC|≥1的基因。在開放訪問網站PubMed2ensembl 中輸入“血運重建（revascularization）”“免疫調節（immunoregulation）”提取所有非重復基因。三者交集為目的基因。

1.3 功能富集分析 利用在線工具DAVID 對目的基因進行功能富集分析，其中基因本體論（GO）對涉及生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）的基因進行注釋[3]；京都基因和基因組百科全書（KEGG）處理基因組、生物途徑、疾病和藥物[4]。

1.4 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡和分析關鍵基因（Hub gene）使用開放數據庫STRING 評估目的基因的PPI 信息，綜合得分＞0.4的被選為顯著[5]。使用軟件Cytoscape 3.8.2 構建PPI 可視化網絡[6]。分子復合物檢測（MCODE）用于發現給定網絡中緊密連接的節點，篩選并可視化PPI 網絡中的重要模塊基因，篩選條件為等級截止=2，k-core=2，節點分數截止=0.2，最大深度=100（degree cut-off=2，k-core=2,node score cut-off=0.2，max depth=100）。PPI 中的Hub 基因通過CytosHubba 根據最大團簇中心性（MCC）原則，選擇最短路徑中的前6 個基因并進行功能富集分析。

1.5 TRRUST 數據庫驗證 結合位點TRRUST v2，根據用戶輸入的功能/途徑/表型基因，查詢關鍵調控因子并進行優先排序[7]。

1.6 實時定量PCR 將RelA-RNAi 慢病毒和陰性對照病毒分別轉染HCASMCs，提取總RNA，用紫外分光光度計測定其濃度和純度。用2-△△ct法分析mRNA的相對表達水平。

1.7 統計學方法 使用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，采用獨立樣本配對t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCI 手術前后RelA 水平比較 以標準品的水平為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算樣品中RelA 水平（表1、圖1）。術前RelA 水平為（13.59±2.69）μg/L，術后RelA 水平為（9.71±2.28）μg/L，支架置入前后RelA 差值為（3.88±3.68）μg/L，差值95%CI：1.75～6.01。術前RelA 水平高于術后，差異有統計學意義（t=3.939，P=0.002）。

圖1 RelA 水平的ROC 曲線圖

表1 血清樣本中RelA的濃度（，μg/L）

表1 血清樣本中RelA的濃度（，μg/L）

2.2 目的基因的功能富集分析 利用GEO2R 分析，獲得217 個與“動脈粥樣硬化”相關的基因。在PubMed2ensembl 中獲得了581 個與“血運重建”相關的基因，615 個與“免疫調節”相關的基因。三者之間的10 個重疊基因為目的基因（圖2）。對其功能富集分析可見，目的基因主要通過白細胞跨內皮遷移途徑參與防御反應（圖3）。

圖2 目的基因圖

圖3 目的基因的功能富集分析

2.3 Hub 基因的獲得與功能分析 基于STRING 數據庫構建的可視化PPI 網絡（圖4），模塊基因（圖5），由8 個節點和24 條邊組成。根據MCC 方法篩選的6 個Hub 基因，包括PTPRC、ITGAM、VCAM1、MMP9、CXCR4 和SPP1，并均屬于模塊基因（圖6）。富集分析顯示，模塊基因與目的基因的作用方向一致，其中關鍵基因主要富集在白細胞的跨內皮遷移途徑中（表2）。

表2 模塊基因的功能富集分析（前2 名）

圖4 目的基因的PPI 網絡

圖5 模塊基因

圖6 關鍵基因

2.4 可調控關鍵基因的轉錄因子分析 在TRRUST數據庫中，MMP9、VCAM1、CXCR4 均受RelA的靶向調節，見表3。

表3 可調控關鍵基因的轉錄因子分析

2.5 RelA 調控Hub 基因的mRNA 表達分析 抑制RelA 可降低HCASMCs 中VCAM1的mRNA 表達，促進MMP9 和CXCR4的mRNA 表達，見圖7；引物序列見表4。

圖7 實時定量PCR 檢測

表4 引物序列

3 討論

動脈粥樣硬化是一種脂質驅動的中大動脈進行性炎癥疾病[8]。隨著人們對疾病的認識，有證據表明[9]，動脈粥樣硬化是一種基于病變內免疫激活和細胞因子信號傳導的免疫介導疾病，免疫反應參與動脈粥樣硬化的各個階段。目前，動脈粥樣硬化性疾病通常通過血管成形術和支架術來實現血管重建，但介入部位的炎癥反應導致的再狹窄可能會再次降低治療效果。因此，動脈內膜切除術和經皮介入等血管手術后再狹窄是動脈粥樣硬化區抗炎治療的首要條件[10]。隨著免疫抑制劑對T 細胞免疫抑制作用的發現和對VSMCs 增殖的抑制，術后再狹窄以藥物洗脫支架的形式得以預防[11]。然而，血運重建后的免疫調節機制尚未完全闡明。

RelA/p65 作為NF-κB 家族的成員之一，含量最為豐富，并具有特殊的反式激活結構域，是炎癥反應基因的有效轉錄激活劑[12]，可調控多個下游靶基因的轉錄活性，參與多種重要的細胞活動。已有研究表明[13]，lncRNA H19 可通過上調RelA 促進動脈粥樣硬化。miR-520c-3p 通過下調RelA 來抑制PDGF-BB介導的增殖、遷移和G2/M 期細胞百分比的降低，進而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成[14]。此外，IL-8 誘導的中性粒細胞胞外陷阱通過激活巨噬細胞中的NF-κB 信號加重動脈粥樣硬化[15]。本研究結果發現，PCI 術后RelA 水平較術前降低（P＜0.05），這可能有利于減輕PCI 術后的炎癥反應。

此外，本研究中生物信息學分析表明，參與血運重建后的免疫調節基因主要與防御反應有關，并通過白細胞跨內皮遷移途徑發揮作用。白細胞通過激活的靜脈壁遷移是一種基本的免疫反應，啟動了白細胞在靜脈壁內和通過靜脈壁的極化運動，受刺激的血管細胞將導致一過性屏障的破壞[16]。因此，白細胞不受控制的跨內皮遷移能夠加劇動脈粥樣硬化進展[17]。同時，本研究結果顯示，與免疫調節相關的VCAM1、MMP9 和CXCR4 均受RelA的直接調控，且RelA的降低抑制了HCASMCs 中VCAM1的mRNA 表達，促進了MMP9 和CXCR4的mRNA 表達。已有研究表明[18-20]，VCAM1的表達能夠促進炎癥反應，加重動脈粥樣硬化病變，CXCR4的表達則抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應，限制動脈粥樣硬化進展。MMP9 在動脈粥樣硬化患者中表達較高[21]，其水平升高不僅與斑塊不穩定有關[22]，還可增加炎性細胞因子的分泌，是心臟重塑中炎癥反應的潛在生物標志物。因此，PCI 術后RelA的降低主要通過調節白細胞跨內皮遷移途徑參與了免疫調節作用。

綜上所述，PCI 術后RelA的降低參與了免疫調節，并主要發揮抑制炎癥反應的作用，但其上調的MMP9 與斑塊不穩定有關，這對PCI 術后的免疫調節治療具有一定的指導意義。