COL3A1對胃癌細胞增殖及侵襲影響的實驗研究

姜洪偉，胡 琦*，王 舉，白鈺靈,套格蘇，李海軍，胡錦峰

(1.內蒙古自治區人民醫院 胃腸外科,內蒙古 呼和浩特010017；2.內蒙古赤峰市敖漢旗醫院 普外科；3.內蒙古赤峰市醫院 肛腸外科)

我國胃癌(GC)發病數占全球的42.6%，死亡數占全球胃癌的45.0%,在全球所有的國家中居發病率第5位、死亡率第6位[1]。細胞外基質(ECM)具有多種功能——它為干細胞創造了一個生態區域，包括調節細胞間化學和機械信號網絡，血管生成，先天和適應性免疫反應，以及細胞的遷移和侵襲[2-3]。ECM成為癌癥進展和治療反應的關鍵調節因子之一，能夠調節癌癥的基本特征[4]。膠原蛋白是ECM的重要組分，COL3A1基因編碼Ⅲ型膠原α-1鏈。A J d’Ardenne 等人[5]早在1984年就對不同良惡性腫瘤中COL3A1的表達進行了免疫組化染色，結果顯示其在所有的腫瘤標本中均為陽性染色；良性腫瘤中以平滑肌瘤、肌腱鞘巨細胞瘤Ⅲ型膠原表達量最高，惡性腫瘤中以平滑肌肉瘤、纖維肉瘤膠原表達量最高。Hongyu Shen等[6]利用在線生物信息軟件預測胃癌中表達上調的基因及其上游miRNAs，并進行生存分析，發現COL3A1在胃癌中表達上調，并且可以預測胃癌的預后。本課題組前期采用實時定量PCR法(qRT-PC)及免疫組化法檢測胃癌及其正常組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平，發現胃癌組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平均顯著高于正常組織。本研究采用靶向COL3A1的干擾慢病毒(3個靶點)及陰性對照慢病毒轉染胃癌細胞株MGC803，嘌呤霉素抗性篩選穩轉細胞株，qRT-PCR法及Western blot法篩選出轉染效率高的胃癌細胞株，進行后續MTT及Transwell實驗，進一步探討COL3Al在胃癌增殖、侵襲及遷移中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器MGC803 細胞(北京 Biobw，bio-81816)、青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽，PB180120)、RPMI-1640 培養基(武漢普諾賽，PM150110/500 ml)、0.25%胰酶(美國 Hyclone，SH30042.01/100 ml)、COL3A1 基因敲除慢病毒(上海吉凱基因)、MTT(上海 Biosharp，5 g)、4%多聚甲醛(上海碧云天，P0099-100 ml)、1%結晶紫染色液(北京索萊寶，G1062)、Matrigel 基質膠(美國BD Biocoat，356234)、PVDF膜(Millipore，ISEQ00010)、ECL發光液(Tanon，180-5001)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime，P0010)、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems，ABI-7500)、微量分光光度計(美國ThermoFisher，Nanodrop 2000)、SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad，Mini Protean 3)、濕法轉膜儀(Bio-Rad，170-3930)、脫色搖床(金壇市醫療儀器，TY-80R)、化學發光檢測系統(Tanon，5200)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 MGC803細胞在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640細胞培養液，37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2細胞轉染 (1)嘌呤霉素濃度篩選：濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、5 μg/ml，培養1周。調整濃度為5×104cells/ml后加入有促轉染劑polybrene(8 μg/ml)新鮮培養基，配置懸液，計算公式：病毒體積=(MOI×細胞數目)/病毒滴度。加入嘌呤霉素后觀察熒光蛋白表達。

1.2.3qRT-PCR法 根據TAKARA PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒的標準操作步驟進行，提取 total RNA，3%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測定RNA濃度和純度,A260/A280比值在1.8-2.0之間。反轉錄后以 cDNA 為模板進行熒光定量 PCR。COL3A1引物序列：正向TTGAAGGAGGATGTTCCCATCT，反向ACAGACACATATTTGGCATGGTT。GAP

DH引物序列：正向GAGTCAACGGATTTGGTCGT，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG。反應體系為cDNA 2 μl、PCR 上游引物 0.4 μl、PCR 下游引物 0.4 μl、SYBR Green solution 10 μl、滅菌雙蒸水 7.2 μl。每個樣品mRNA相對表達量通過計算其各自的Ct值計算得出。

1.2.4Western blot法 培養基PBS洗滌，1000轉離心 5 min，將細胞濃度調整為3×104cells/ml。接種于培養板培育48 h。PBS洗滌后，0.2 ml/孔加入裂解液，置入-80℃超低溫冰箱中。離心后留下細胞上清液，-20℃下保存。配置BCA工作液：按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl的濃度量加入96孔中。加入BCA工作液孵育。測定吸光度值。清洗玻璃板后灌膠，80V電泳30 min，樣品進入分離膠后，改120V電泳90 min。電流320 mA開始轉膜。轉膜結束后用1×麗春紅染液染膜5 min。浸泡TBS后,轉移到5%脫脂奶粉、TBST溶液的平皿中,脫色搖床封閉。TBST稀釋一抗，4℃孵育，脫色搖床清洗10 min，重復3次。二抗的孵育首先使用TBST溶液1∶5000稀釋，然后孵育2h，脫色三次。用Tanon ECL作為發光試劑，Tanon 5200化學發光成像儀拍照，留下拍照后圖片。

1.2.5MTT實驗 培養基終止消化后離心5 min。倒掉上清，加入3 ml培養基重懸細胞。胰酶消化細胞，離心后去上清，重懸細胞。細胞接種在6孔板中，每孔1×106個細胞，接種后培養12 h貼壁。敲減COL3A1處理下，細胞培養至設定時間(0、12、24、48 h)后，每孔分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養4 h后去除，加入150 μl DMSO搖勻。吸光值用酶標儀進行測定，波長570 nm，根據吸光值和時間繪制生長曲線。

1.2.6細胞遷移實驗 PBS洗滌后胰酶消化，放入新培養基計數。10% FBS的培養液加入孔板，使細胞濃度為(5×105/ml)，Transwell小室加入100 μl 懸液并放培養24 h。取出小室，吸凈培養液后清理掉上層細胞，PBS洗滌，甲醇固定。PBS洗滌三次，擦干后使用1%結晶紫染液染色后PBS清洗3次，常溫倒置晾干。顯微鏡下(200倍)拍照并計算各視野中穿膜細胞的平均數。

1.2.7細胞侵襲實驗 將無血清培養基與預冷的Matrigel基質膠9∶1混勻。

將上步Matrigel基質膠100 μl加入Transwell小室，然后放入37℃、5% CO2培養箱中，等待基質膠凝固。其余實驗步驟同遷移實驗相同。

1.3 統計學分析實驗所得數據采用平均數±標準差(Mean±SD)表示，每組實驗至少重復三次，數據處理軟件為GraphPad Prism 6，兩組樣本均值之間的比較采用t檢驗，多組樣本均值之間的比較采用ANOVA檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞培養

常規培養MGC803胃癌細胞株，發現正常的MGC803細胞多為梭形或多角形，也有部分為圓形。呈單核、單層貼壁生長的特點(圖1)。

圖1 光鏡下 MGC803 細胞形態觀察(200 倍)

2.2 MGC803細胞轉染

靶向COL3A1的干擾慢病毒轉染48 h后，倒置熒光顯微鏡下可見COL3A1 shRNA慢病毒成功轉染到MGC803細胞內(圖2)。將穩定轉染的干擾組及對照組細胞株分別分為陰性對照組(NC組)、shRNA 1組、shRNA 2組和shRNA 3組，未轉染慢病毒的細胞株為空白對照組(Control組)。

圖2 轉染后細胞熒光攜帶情況

用qRT-PCR和Western blot法篩選出轉染效率最高的細胞株，qRT-PCR結果顯示：轉染shRNA-COL3A1慢病毒后，COL3A1的mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)；與NC組相比，COL3A1在shRNA 1組、shRNA 2組、shRNA 3組的mRNA表達同樣顯著下降，而NC組與Control組相比細胞的mRNA表達無明顯變化(P>0.05)，在這三組中抑制效果最好的是shRNA 1組(P<0.01)、shRNA 3組(P<0.001)(圖3)。選擇shRNA 1組和shRNA 3組進行后續實驗，后續實驗中shRNA 1組及shRNA 2組為該步中的shRNA 1組和shRNA 3組。重新分組后進行Western Blot實驗，結果表明，shRNA-COL3A1轉染后,胃癌細胞中COL3A1的蛋白表達水平均顯著降低，其中shRNA 2組抑制效果更顯著(P<0.01)(圖4)，這與PCR的結果一致。

圖3 shRNA-COL3A1轉染后COL3A1 mRNA表達水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs.Control；##P<0.01，### P<0.001vs.NC)

A：WB曝光條帶；B：COL3A1的蛋白表達水平

2.3 MGC803 MTT

轉染后各組細胞增殖能力通過MTT法檢測(表1)，通過繪制不同時間點的光吸收值得到生長曲線，結果發現shRNA-COL3A1轉染后，胃癌細胞的生長在48 h內受到明顯抑制，在各時間點OD值均低于NC組(P<0.05)，其中shRNA 2組抑制效果最為顯著(P<0.0001)(圖5)。

表1 敲減COL3A1后各組MGC803細胞平均吸光值(OD值：Mean±SD)

圖5 shRNA-COL3A1轉染后48 h內胃癌細胞增殖情況 (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001 vs NC，n=3)

2.4 MGC803細胞遷徙

通過Transwell小室檢測細胞遷移情況，計數膜下細胞數。結果發現shRNA-COL3A1轉染后，shRNA 1組(P=0.0029)及shRNA 2組(P<0.0001)胃癌細胞的遷移能力顯著降低，其中以shRNA 2組最為顯著(P<0.0001)(圖6)。

A：顯微鏡下穿膜細胞觀察(200 倍)；B：各組穿膜細胞數量統計

2.5 MGC803細胞侵襲

通過Transwell小室(加Matrigel基質膠)檢測細胞侵襲能力，結果發現shRNA-COL3A1 轉染后，shRNA 1組(P=0.0046)及shRNA 2組(P=0.0002)胃癌細胞的侵襲能力均顯著降低，其中同樣以shRNA 2組最為顯著(P<0.001)(圖7)。

A：顯微鏡下穿膜細胞觀察(200倍)；B：各組穿膜細胞數量統計

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移是癌癥相關死亡的主要原因，為了進一步探究COL3A1與胃癌的關系，本研究通過COL3A1敲減的慢病毒轉染人胃癌細胞株BGC-803，并檢測經處理后胃癌細胞的遷徙及侵襲能力，結果顯示敲減COL3Al能抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲，說明COL3Al可能是胃癌侵襲及轉移過程中的重要角色。推測這是由于COL3A1表達降低后胃癌細胞周圍膠原網絡剛度下降所致。細胞外基質硬化導致的細胞內收縮可引起肌動蛋白硬度和細胞遷移增加[7]。腫瘤硬度增加可能在幾個方面調節腫瘤進展。例如增加基質剛度會增加細胞骨架張力，以促進粘連聚集，并增加生長因子依賴性的胞外調節蛋白激酶(ERK)[8]。此外，基質剛度促進整合素聚類，導致黏著斑激酶1(FAK1)的激活，進而激活ERK通路，引起細胞遷移、侵襲和增殖[9]。小鼠腫瘤模型中FAK1的缺失抑制了腫瘤細胞的局部侵襲和轉移，這表明FAK1的激活可能是引起腫瘤ECM剛度增加、促進腫瘤細胞轉移的重要介質[10]。王頡[11]等發現COL3A1可以通過蛋白激酶B(PKB) /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路發揮促結腸癌腫瘤生長的作用。Wang Xiao-Qing[12]等同樣發現COL3A1在結直腸癌中存在過表達，并且是影響預后的危險因素，COL3A1還可以通過刺激磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT信號通路促進結腸癌細胞增殖。Becky[13]等學者通過體外動物實驗發現當COL3A1缺乏后，乳腺癌的黏附、侵襲和遷移均被抑制，癌細胞的增殖能力增強。而艾爾肯·肉孜比拉力[14]等的研究結果則不同，她們發現COL3A1在宮頸癌中為低表達，且人乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性的宮頸癌細胞COL3A1的表達水平更高，過表達COL3A1后的宮頸癌細胞遷徙能力下降，這提示 COL3A1 在不同腫瘤中可能存在不同的功能。引起這種不同結果的原因可能是ECM與腫瘤細胞間復雜的動態變化所致。

綜上所述，COL3A1在惡性腫瘤的發生發展過程中扮演著重要的角色，這為探究微環境與腫瘤細胞之間的相互作用提供了新的思路。但是COL3A1與胃癌的關系還是有待進一步的深入研究。本研究因客觀原因仍存在很多不足，如未檢測COL3A1在不同胃癌細胞系中的基礎表達情況，也未構建COL3A1過表達細胞系對其在胃癌增殖、轉移中的作用進一步作證，這也是我們下一步的研究方向。