人血漿中左乙拉西坦和卡馬西平同時測定方法的建立

史敏 任炳楠 吳惠珍 劉平 吳茵

中圖分類號 R969.1;R971+.6 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）08-0987-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.08.14

摘 要 目的 建立同時測定人血漿中左乙拉西坦和卡馬西平濃度的方法。方法 血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，以卡馬西平-D10為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定其中左乙拉西坦和卡馬西平的濃度。以XBridge BEH C18為色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為0.35 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL;離子源為電噴霧離子源，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 171.3→126.3（左乙拉西坦）、m/z 237.1→194.1（卡馬西平）、m/z 247.1→204.1（內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果 左乙拉西坦和卡馬西平檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.5～50、0.2～20 μg/mL（r分別為0.997 3、0.998 5），定量下限分別為0.5、0.2 μg/mL;日內(nèi)、日間RSD均不高于10.00%，日內(nèi)、日間RE均在±4.00%之內(nèi)，平均提取回收率為95.60%～105.00%，平均內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子為98.40%～110.00%，穩(wěn)定性試驗的RSD均不高于5.60%。采用該法測得22例患者血漿中左乙拉西坦、卡馬西平的濃度分別為3.36～40.90、3.64～9.93 μg/mL。結(jié)論 所建同時測定人血漿中左乙拉西坦、卡馬西平濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于癲癇患者血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 左乙拉西坦;卡馬西平;血藥濃度;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Establishment of the method for simultaneous determination of levetiracetam and carbamazepine in human plasma

SHI Min1，2，REN Bingnan2，WU Huizhen2，LIU Ping1，WU Yin1，2（1. Graduate School， Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China; 2. Dept. of Pharmacy， Hebei General Hospital， Shijiazhuang 050051， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish the method for simultaneous determination of levetiracetam and carbamazepine concentrations in human plasma. METHODS After plasma samples were precipitated with methanol， using carbamazepine-D10 as the internal standard， the concentrations of levetiracetam and carbamazepine were determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. The determination was performed on XBridge BEH C18 column with methanol-0.1% formic acid as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 0.35 mL/min. The column temperature was set at 40℃， and sample size was 2 μL. With electrospray ion source， a multiple reaction monitoring mode was used for positive ion scanning; the detected ion pairs for quantitative analysis were m/z 171.3→126.3 （levetiracetam）， m/z 237.1→194.1 （carbamazepine）， 247.1→204.1 （internal standard）. RESULTS The linear range of the concentrations of levetiracetam and carbamazepine were 0.5-50 and 0.2-20 μg/mL （r=0.997 3 and 0.998 5）， respectively; the lower quantitative limits were 0.5 and 0.2 μg/mL， respectively. RSDs of intra-day and inter-day were all no more than 10.00%. RE of intra-day and inter-day were within ±4.00%; the average extraction recoveries rate were 95.60%-105.00%; the average internal standard correction matrix factors were 98.40%-110.00%; RSDs of stability tests were all not higher than 5.60%. The concentrations of levetiracetam and carbamazepine in the plasma of 22 patients measured by this method were 3.36-40.90 and 3.64-9.93 μg/mL， respectively. CONCLUSIONS The established method for determining the concentration of levetiracetam and carbamazepine in human plasma is fast， sensitive， accurate and stable， and can be used for the monitoring of plasma concentration and pharmacokinetic study in epilepsy patients.

KEYWORDS ? levetiracetam; carbamazepine; plasma concen- tration;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

卡馬西平為傳統(tǒng)抗癲癇藥，可用于治療癲癇大發(fā)作和復(fù)雜部分性發(fā)作，且對精神運動性發(fā)作的療效較好，還可用于治療三叉神經(jīng)痛和舌咽神經(jīng)痛，是臨床上較常用的廣譜抗癲癇藥[1]。但由于該藥的治療窗窄、個體差異大、療效及不良反應(yīng)與血藥濃度密切相關(guān)，所以臨床常需要對其進行治療藥物監(jiān)測以幫助提高療效或降低不良反應(yīng)發(fā)生率[2]。左乙拉西坦為第二代廣譜抗癲癇藥，可有效控制部分頑固性癲癇發(fā)作，其藥動學(xué)參數(shù)與劑量成線性相關(guān)，且藥物間相互作用較小[3]。但相關(guān)研究指出，對于特殊人群尤其是危重患者和孕婦、兒童、老年患者，仍需對其血藥濃度進行監(jiān)測[4]。抗癲癇治療常采用多藥聯(lián)合以提高療效，《抗癲癇藥應(yīng)用專家共識》指出，對于癥狀性部分性癲癇發(fā)作的患者，臨床可使用左乙拉西坦聯(lián)合卡馬西平治療[5]。臨床實踐表明，兩藥聯(lián)合可協(xié)同增效，能以不同作用機制抑制癲癇發(fā)作，從而降低患者的發(fā)作頻率，并有效改善其認知水平[6]。癲癇治療的個體差異大，聯(lián)合用藥方案易受患者年齡、體質(zhì)量等自身因素的影響，故為確保患者用藥的安全性和有效性，在臨床治療中需要開展及時、準(zhǔn)確的治療藥物監(jiān)測，定期檢測患者體內(nèi)的藥物濃度，為制訂最優(yōu)的個體化給藥方案提供依據(jù)。目前，抗癲癇藥血藥濃度常用的檢測方法有均相酶免疫法、高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法，但上述方法耗時長且操作復(fù)雜[7-10]。本文擬運用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法同時測定人血漿中左乙拉西坦和卡馬西平的濃度，以期為兩藥聯(lián)合個體化方案的制訂和藥動學(xué)的研究提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-20AD型高效液相色譜系統(tǒng)及AB Sciex Thriple Quad 3200MD型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司），XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TGL-16M型高速離心機（湖南湘儀實驗實儀器開發(fā)有限公司），NewClassic型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

左乙拉西坦對照品（批號15J-SPF-82-1，純度98.7%）購自美國Panphy Chemicals公司;卡馬西平對照品（批號100142-201105，純度99.7%）購自中國食品藥品檢定研究院;卡馬西平-D10對照品（內(nèi)標(biāo)，批號L-072，純度99.4%）購自加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司;甲醇、甲酸（批號分別為1140207、F0167，均為色譜純）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純凈水。

1.3 血漿

健康人空白血漿由河北省人民醫(yī)院體檢中心提供，樣本血漿為河北省人民醫(yī)院門診及住院患者檢測樣本（醫(yī)學(xué)倫理批件號2022046）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 以XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.3 min，15%A;0.3～1.5 min，15%A→95%A;1.5～3.6 min，95%A;3.6～3.8 min，95%A→15%A）;流速為0.35 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣器溫度為4 ℃;進樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，離子源溫度為550 ℃;以多反應(yīng)監(jiān)測模式進行正離子掃描;離子源噴射電壓為5 500 V;霧化氣壓力為55 psi;加熱氣壓力為50 psi;氣簾氣壓力為20 psi;用于定量分析的離子對分別為m/z 171.3→126.3（左乙拉西坦）、m/z 237.1→194.1（卡馬西平）、m/z 247.1→204.1（內(nèi)標(biāo)），解簇電壓均為110 V，碰撞能量分別為18、15、15 V。左乙拉西坦、卡馬西平以及內(nèi)標(biāo)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取左乙拉西坦、卡馬西平對照品各適量，分別置于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成上述成分質(zhì)量濃度分別為1、0.4 mg/mL的對照品儲備液，置于-20 ℃保存，備用。精密吸取上述對照品儲備液適量，混合后用甲醇稀釋成兩者質(zhì)量濃度分別為500、200 μg/mL的混合對照品工作液，再用甲醇稀釋成左乙拉西坦質(zhì)量濃度分別為350、250、100、50、10、5 μg/mL，卡馬西平質(zhì)量濃度分別為140、100、40、20、4、2 μg/mL的混合對照品工作液，備用;同法制得左乙拉西坦質(zhì)量濃度分別為400、200、15、5 μg/mL，卡馬西平質(zhì)量濃度分別為160、80、6、2 μg/mL的混合質(zhì)控工作液，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密量取二甲基亞砜1 mL，精密加入卡馬西平-D10對照品1.04 mg，溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.04 mg/mL的儲備液。精密量取上述儲備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為290 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

精密量取血漿樣品10 μL，加入290 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液90 μL，渦旋2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL，加入50%甲醇90 μL稀釋后，取2 μL進樣分析。

2.4 專屬性考察

分別取6份不同來源的空白血漿、空白血漿+混合對照品溶液（左乙拉西坦質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，卡馬西平質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL）和樣本血漿，按“2.3”項下方法處理（空白血漿不加入內(nèi)標(biāo)溶液），再按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，左乙拉西坦、卡馬西平、內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰形良好，保留時間分別約為2.5、3.2、3.2 min，內(nèi)源性物質(zhì)對各成分測定無明顯干擾，表明方法專屬性良好，其提取離子流圖見圖2。

2.5 線性關(guān)系與定量下限考察

取空白血漿90 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，加入“2.2.1”項下混合對照品工作液10 μL，渦旋1 min，制成左乙拉西坦質(zhì)量濃度分別為50、35、25、10、5、1、0.5 μg/mL，卡馬西平質(zhì)量濃度分別為20、14、10、4、2、0.4、0.2 μg/mL的模擬血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，根據(jù)最小二乘法（權(quán)重1/x 2）進行線性回歸，得左乙拉西坦的回歸方程為y=0.199 0x+0.013 9（r=0.997 3），卡馬西平的回歸方程為y=0.294 0x+0.040 7（r=0.998 5），兩者檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.5～50、0.2～20 μg/mL，定量下限分別為0.5、0.2 μg/mL。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗

按“2.5”項下方法配制左乙拉西坦定量下限（0.5 μg/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（1.5、20、40 μg/mL），卡馬西平定量下限（0.2 μg/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（0.6、8、16 μg/mL）的模擬血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下測定條件進樣分析，每個質(zhì)量濃度平行測定6份，計算日內(nèi)精密度（以RSD表示）;連續(xù)測定3 d，計算日間精密度（以RSD表示）。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿樣品中左乙拉西坦、卡馬西平的質(zhì)量濃度，以實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進行比較，計算準(zhǔn)確度（以RE表示）。結(jié)果見表1。

2.7 提取回收率試驗

按“2.5”項下方法配制左乙拉西坦低、中、高質(zhì)量濃度（1.5、20、40 μg/mL），卡馬西平低、中、高質(zhì)量濃度（0.6、8、16 μg/mL）的混合血漿質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R1。另取空白血漿，按“2.3”項下方法處理（不加入內(nèi)標(biāo)）后，加入混合質(zhì)控工作液及內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL，按“2.2.2”項下方法制得，下同）適量，獲得與上述混合血漿質(zhì)控樣品中待測成分及內(nèi)標(biāo)相同質(zhì)量濃度的樣品，按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R2。每個質(zhì)量濃度平行測定6份，按下式計算提取回收率：提取回收率=（R1的平均值）/（R2的平均值）×100%，結(jié)果見表1。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

取6份來源不同的空白血漿，按“2.3”項下方法處理（不加入內(nèi)標(biāo)）得到空白基質(zhì)，加入低、高質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控工作液及內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL），按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積。另用甲醇稀釋低、高質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控工作液，得到與上述樣品質(zhì)量濃度相同的樣品，加入等量內(nèi)標(biāo)，按“2.1”項下測定條件進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積。按下式計算內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子：內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子=[（有基質(zhì)存在時待測成分峰面積/無基質(zhì)存在時待測成分峰面積）/（有基質(zhì)存在時內(nèi)標(biāo)峰面積/無基質(zhì)存在時內(nèi)標(biāo)峰面積）]×100%。結(jié)果顯示，左乙拉西坦的平均內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子為104.70%～110.00%（RSD≤5.03%，n=6），卡馬西平的平均內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)因子為98.40%～101.60%（RSD≤3.8%，n=6），提示左乙拉西坦和卡馬西平的檢測不受基質(zhì)的影響。

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.7”項下方法配制左乙拉西坦、卡馬西平低、中、高質(zhì)量濃度的混合血漿質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理，分別于處理前在-20 ℃下放置14 d、-20 ℃～室溫循環(huán)凍融3次、室溫放置24 h，處理后在進樣器中放置24 h，再按“2.1”項下測定條件進樣分析，每個條件平行測定6次，考察穩(wěn)定性（以RSD表示）。結(jié)果見表2。

2.10 測定方法的應(yīng)用

收集22例患者的樣本血漿，其中單用左乙拉西坦的患者10例、單用卡馬西平的患者10例、同時使用兩種藥物的患者2例，收集其全血至少1 mL（所有患者已連續(xù)服藥1周并在下次服藥前采集血樣），置于含乙二胺四乙酸的采血管中，以3 500 r/min離心10 min后分離上層血漿，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下測定條件進樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算患者血漿中左乙拉西坦和卡馬西平的濃度，每個樣本檢測1次，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，所測血藥濃度均在定量分析的線性范圍內(nèi)，左乙拉西坦的變異系數(shù)大，提示不同患者體內(nèi)左乙拉西坦血藥濃度的差異大。

3 討論

本文建立了同時測定左乙拉西坦、卡馬西平血藥濃度的HPLC-MS/MS法，該方法操作簡單、分析時間短，3.8 min內(nèi)即可完成對兩種藥物的快速分析，大大縮短了檢測時間，節(jié)省了檢測成本。此外，建立治療藥物監(jiān)測方法時還需要考慮臨床的可操作性，特別是對于采血困難的患者（如兒童等特殊人群），開發(fā)可同時測定多種藥物血藥濃度的方法很有必要。本文所建立的方法僅使用10 μL血漿就可同時測定兩種抗癲癇藥的血藥濃度，對于采血困難的患者也可順利實施治療藥物監(jiān)測。

卡馬西平治療窗窄，不良反應(yīng)多，其推薦的治療濃度監(jiān)測范圍為4～12 μg/mL[11]。左乙拉西坦在特殊人群中的個體差異較大，其推薦的治療濃度監(jiān)測范圍為20～40 μg/mL[12]。本文建立的方法中左乙拉西坦、卡馬西平的線性范圍均可覆蓋其有效治療濃度范圍，可用于抗癲癇聯(lián)合用藥方案的血藥濃度檢測。

本文采用的血漿樣品前處理方法為蛋白沉淀法，與液液萃取法及固相萃取法等方法[13-14]相比，蛋白沉淀法的操作簡單，所用材料、試劑更少，所耗時間更短，更適用于臨床治療藥物監(jiān)測。本方法在沉淀蛋白后，離心取血漿樣品上清液，用50%甲醇進一步稀釋10倍后再進樣分析，可減少基質(zhì)效應(yīng)對液質(zhì)聯(lián)用方法測定藥物濃度的影響。

綜上所述，本文成功建立了同時測定血漿中左乙拉西坦、卡馬西平濃度的方法。該方法操作簡便、分析快速、樣品處理方法簡單，適用于兩藥的血藥濃度監(jiān)測及藥動學(xué)研究。

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（收稿日期：2021-12-22 修回日期：2022-03-24）

（編輯：鄒麗娟）