亞低溫對急性心肌梗死SD大鼠心肌保護的實驗研究

高仁俊　　王顯艷　　張鑫蕊　　肖章博　　張鳳嬌　　蔡彧　　趙紅曄　　李懿桐　　宗浩　　王艷麗

[摘要] 目的 實驗觀察誘導亞低溫（32℃～36℃）治療對SD大鼠急性心肌梗死后心肌的保護。 方法 40只健康SD大鼠隨機分為兩組，即常溫對照組和誘導亞低溫實驗組，建立急性心肌梗死（AMI）實驗模型，結扎左前降支近端，結扎后1 h后再解除結扎，4 h后分別測定兩組大鼠的左心室射血分數（LVEF）、心率（HR）和左室舒張末期壓（LVEDP）、心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率。 結果 亞低溫組治療后LVEF、SOD水平明顯高于常溫組，差異有統計學意義（P<0.05）;亞低溫組治療后HR、LVEDP、MDA水平、心肌細胞凋亡率均明顯低于常溫組，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論? 亞低溫治療通過降低心室率，提高左心室射血分數，改善左室舒張末期壓以及降低心肌的氧化應激損傷及細胞凋亡率，來保護左心室心功能，從而達到對急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌的保護，最終降低病死率。

[關鍵詞] 急性心肌梗死;亞低溫;心功能;氧化應激損傷;細胞凋亡

[中圖分類號] R541.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）09-0030-04

Experimental study on mild hypothermia on myocardial protection in SD rats with acute myocardial infarction

GAO Renjun1? WANG Xianyan2? ZHANG Xinrui1? XIAO Zhangbo3? ZHANG Fengjiao1? CAI Yu1? ZHAO Hongye4? LI Yitong1? ?ZONG Hao1? ?WANG Yanli1

1.Sixth Department of Cardiology， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006，China;2.Department of Pathology， Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China;3.Department of Scientific Research， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China;4. Department of Physiology， Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China

[Abstract] Objective? ?To observe the myocardial protection of induced mild hypothermia （32℃～36℃） in SD rats with acute myocardial infarction through experiment. Methods? A total of 40 healthy SD rats were randomly divided into two groups as the normal temperature control group and the induced mild hypothermia experimental group. An acute myocardial infarction （AMI） experimental model was established. The proximal left anterior descending artery was ligated and then released 1 hour after ligation. After 4 hours， the left ventricular ejection fraction （LVEF）， heart rate （HR）， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， superoxide dismutase （SOD） level， and malondialdehyde （MDA） level were detected in the two groups. TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis rate. Results? After treatment， the levels of LVEF and SOD in the mild hypothermia group were significantly higher than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. After treatment， the levels of HR， LVEDP， MDA， and the myocardial cell apoptosis rate in the mild hypothermia group were significantly lower than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion? Mild hypothermia therapy protects left ventricular function by decreasing HR， increasing LVEF， improving LVEDP， and reducing myocardial oxidative stress damage and cell apoptosis rate， to protect ischemia/reperfusion myocardium after acute myocardial infarction， to ultimately reduce mortality rate.

[Key words] Acute myocardial infarction; Mild hypothermia; Cardiac function; Oxidative stress injury; Apoptosis

目前，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致殘率仍排在心血管疾病的首位，盡最大可能快速開通閉塞冠脈是治療的關鍵。多方證實已在此過程中的心肌缺血/再灌注損傷會引起心肌頓抑、氧化應激反應、炎性反應、細胞凋亡等，最終影響患者病死率、心臟功能及預后。因此，如何減輕心臟負荷、干預氧化應激反應、減輕炎性反應和減少細胞凋亡等顯得尤為重要。多年來，科研工作者及臨床工作者均在探索可以減輕心肌缺血/再灌注損傷的方法。

目前，已證實亞低溫在減輕氧化應激反應、細胞凋亡、心功能等方面對心肺復蘇、腦組織、腎臟組織等起到保護作用。且有研究證明對急性梗死心肌進行治療時可同時干預心功能和氧化應激反應[1-4]。

本項實驗研究中，通過制備SD大鼠急性心肌梗死模型，將左前降支急性閉塞1 h后，再打開結扎進行再灌注，達到心肌缺血/再灌注損傷狀態，觀察4 h后，以左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心率（heart rate，HR）和左室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、心肌組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平及TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率為觀察指標，探討亞低溫對缺血/再灌注心肌組織的心功能、氧化應激損傷及細胞凋亡的影響，從而得出亞低溫治療可以保護急性缺血/再灌注心肌的結論。現將所得結果報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由黑龍江省齊齊哈爾醫學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（黑） 2018-001。所有的動物處置均嚴格遵守國際倫理標準相關要求執行，并已順利通過齊齊哈爾醫學院倫理委員會嚴格審議。

1.2 實驗試劑與儀器

超氧化物歧化酶（SOD）檢測實驗試劑盒（生產批號：20190506）、丙二醛（MDA）檢測實驗試劑盒（生產批號：20190308）、TUNEL細胞凋亡原位檢測實驗試劑盒（生產批號：20190602）均購自南京建成生物工程研究所，DW-3000C型小動物有氧呼吸機購自北京眾實迪創科技產業發展股份有限責任公司。

1.3動物分組與造模

40只SD大鼠采用數字表法隨機分為A組（亞低溫治療組）和B組（常溫對照組），每組各20只。

急性心肌梗死模型的建立：兩組大鼠均持續監測直腸溫度4 h，其中給予誘導亞低溫的每只大鼠最低有效劑量的苯巴比妥鈉，以防止發抖。麻醉大鼠后，直視下氣管插管術，所有大鼠均采用正壓呼吸機通氣[潮氣量70～80 ml，呼吸頻率（12～14）次/min，吸呼比2∶1]。在第4肋間行左胸垂直切口，打開心包露出心臟。心臟在閉塞前滴入0.5%的利多卡因。左前降支開口以遠約2 mm處用5-0縫線結扎，用心電圖觀察術前、術后肢體導聯ST段的變化，以ST段弓背向上抬高來確定手術成功，維持1 h后解開結扎，使心肌再灌注，關胸，全程心電圖監測，并保存。

造模成功后，常溫組大鼠給予尾靜脈注射一定量的常溫生理鹽水1.0 ml/（min·kg），并置于毯子中，保持體溫（36℃～38℃）;亞低溫大鼠則可通過尾靜脈輸送4 ℃生理鹽水1.0 ml/（min·kg），誘導亞低溫狀態，持續肛溫測量，維持肛溫32℃～36℃。

1.4 觀察指標

1.4.1 心功能指標的測定? 使用 Vevo770 型號超聲儀（Visualsonics Inc，Canada），用17.5 MHz探頭，采用M模塊采集LVEF、HR和LVEDP數值，分別測出常溫組及亞低溫組3個心動周期的平均值。

1.4.2 SOD、MDA檢測方法? 留取每只大鼠左心室心尖部的心肌，以冰生理鹽水進行沖洗，經差速離心法提取心肌勻漿蛋白，分別用于檢測大鼠心肌細胞內SOD、MDA的含量。按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3心肌細胞凋亡檢測方法? 實驗方法具體采用TUNEL法，自結扎線下0.5 cm 處切取一小塊心肌組織，將其置入10%多聚甲醛固定，24 h后行常規石蠟包埋、切片，貼附于其表面涂有多聚賴氨酸的載玻片上，檢測心肌細胞凋亡率。按檢驗試劑包裝盒的使用說明書規定執行。

于光鏡下進行觀察每個細胞核內部含有綠色熒光的細胞為凋亡細胞。每張細胞切片隨機分別選取5個視野（×200），算出凋亡細胞和正常細胞的視野數量，得出AI。AI=視野中凋亡細胞數量/視野中細胞總數量×100%。

1.5統計學分析

各組數據采用SPSS 22.0軟件處理，計量資料以（x±s）表示，采用One Way ANOVA對兩組間的差異進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兩組大鼠左心功能指標變化情況比較

亞低溫治療組左心室射血分數（LVEF）明顯高于常溫組，差異有統計學意義（P<0.05）;而亞低溫治療組的心率（HR）和左室舒張末期壓（LVEDP）明顯低于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1? ?兩組SD大鼠左心功能變化情況比較（x±s，n=20）

2.2兩組大鼠心肌氧化應激損傷指標比較

亞低溫治療組心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）明顯高于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;亞低溫治療組丙二醛（MDA）明顯低于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2? ?兩組大鼠氧化應激損傷指標比較（x±s，n=20）

2.3兩組大鼠心肌細胞平均凋亡率變化比較

亞低溫治療組大鼠心肌細胞凋亡率為（17.63±1.98）%，明顯低于常溫對照組（28.86±2.97）%，差異有統計學意義（F=14.08，P<0.001）（圖1）。

3 討論

急性心肌梗死的搶救要求盡早開通閉塞冠脈，但是搶救過程中的缺血/再灌注損傷在所難免，所導致的心肌細胞氧化應激損傷、心肌頓抑、心肌細胞凋亡以及左心功能下降[4-5]，是影響病死率和預后的本質。大量文獻證實，亞低溫對機體組織的缺血/再灌注的保護作用已經在臨床中被廣泛應用[6-9]，如大面積腦梗死患者，經過溶栓或介入方法使腦血管再通，即可出現腦組織的缺血/再灌注損傷，亞低溫治療聯合呋塞米可以達到腦保護的效果。而對于心臟驟停的患者，同樣涉及到各個重要臟器的缺血/再灌注損傷，有研究中針對心臟驟停患者應用亞低溫治療，觀察復蘇后心肌、腎臟、肺臟等功能恢復情況及損傷程度評估，發現亞低溫治療確能對人體重要臟器發揮保護作用。吸取大量的應用亞低溫治療的臨床和實驗室經驗，在本研究中針對亞低溫對急性梗死心肌的保護機制進行觀察，以心率、左室舒張末期壓、左心室收縮功能、心肌細胞氧化應激損傷指標以及心肌細胞凋亡率為觀察指標，探討亞低溫在急性心肌梗死治療中對心肌的保護效果。

目前，氧化應激代謝激活被廣泛公認是一種大腦神經組織缺血后功能恢復或出現大量血液供給后的腦損傷的主要代謝機制[10-11]，MDA是一種氧化應激代謝反應的最終代謝產物，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，具有細胞毒性，其含量能反映氧化應激程度。超氧化物歧化酶（SOD）也可以通過直接參與對氧自由基的激活清除，拮抗氧化應激，測量二者水平可間接觀察機體的氧化應激反應所致的細胞損傷程度[12]。另外，在缺血、缺氧及再灌注過程中心肌細胞不僅出現大量的氧化應激損傷，還可能會導致心肌細胞發生凋亡[13-14]，主要位于心肌梗死邊緣地帶。而心肌細胞的氧化應激反應及細胞凋亡直接影響預后和心功能。所以，在本次誘導亞低溫治療急性心肌梗死的動物實驗研究中，將心率（HR）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室射血分數（LVEF）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、細胞凋亡率設定為兩組SD大鼠急性心肌梗死治療中的重要觀察指標，結果顯示亞低溫治療組LVEF明顯高于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05），說明亞低溫治療可以改善急性心肌梗死大鼠的左室心功能。而HR、LVEDP均明顯低于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05），說明亞低溫治療可以降低心室率，阻止交感神經興奮的代償反應，從而降低心肌耗氧量，并改善左室舒張末期壓力。亞低溫治療組SOD（U/L）明顯高于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05），且MDA（mmol/L）明顯低于常溫對照組，差異有統計學意義（P<0.05），說明亞低溫治療組相比對照組有更強的氧自由基的激活清除能力和拮抗氧化應激的能力;氧化應激代謝反應的最終代謝產物MDA值低于對照組，說明亞低溫治療相比對照組可以減少氧化應激損傷的最終代謝產物生成。另外，本項研究結果中證實亞低溫組細胞凋亡率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01），說明亞低溫治療方法可以有效干預急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌細胞的凋亡率。

綜上所述，在SD大鼠的急性心肌梗死治療中應用亞低溫技術，可以降低心室率及左室舒張末期壓力，提高左室射血分數，降低氧化應激損傷及心肌細胞凋亡的幾率，以改善心肌梗死后心功能和預后。從而證實亞低溫治療可以對急性心肌梗死后的心肌產生明顯的防御保護作用，且此種治療措施簡單易行，容易在臨床中推廣應用。

另外，缺血/再灌注可以引起線粒體微結構發生改變，而線粒體是真核細胞氧化磷酸化產生三磷酸腺苷（ATP）的重要場所，主要承擔著調控細胞能量代謝和凋亡通路的任務，同樣，心肌細胞的氧化應激反應可以引起心肌細胞的損傷，甚至心肌細胞凋亡。下一步將進行亞低溫治療對線粒體結構和功能的影響，以及亞低溫與心肌細胞凋亡的信號通路及相關凋亡蛋白的關系。本項研究為其打下堅實的基礎，提供基礎實驗數據，最終期望能阻止心肌細胞缺血/再灌注的損傷通路，使急性心肌梗死患者獲益，為臨床急性心肌梗死患者的治療提供更多的、科學的實驗依據。

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（收稿日期：2021-11-06）