凍干豬膽粉的HPLC指紋圖譜和含量測定方法的研究

王進吉 鄒瓊 張磊 伍曉萍 陳彤

摘要：篩選HPLC色譜條件，用于凍干豬膽粉的HPLC指紋圖譜測定及凍干豬膽粉中牛磺豬去氧膽酸含量的測定，并與5批非凍干技術制備的市售豬膽粉進行對比。應用Shim-pack GIST-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調節pH=4.3）為流動相，梯度洗脫（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A），流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長200 nm。采用上述色譜條件測定10批凍干豬膽粉，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”建立凍干豬膽粉對照指紋圖譜，確定11個共有峰，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經相似度計算，規定5分鐘后的色譜峰相似度不得低于0.95。10批凍干豬膽粉的指紋圖譜相似度均大于0.995;5批市售豬膽粉中只有1批的相似度大于0.95。10批凍干豬膽粉中牛磺豬去氧膽酸的平均含量為5.56%±6.33%，5批市售豬膽粉中牛磺豬去氧膽酸的平均含量為0.99%±132.32%，僅有一批符合規定。冷凍干燥法制備的豬膽粉質量優于5批市售產品，凍干技術可用于生產優質豬膽粉。

關鍵詞：凍干豬膽粉;HPLC-UV法;指紋圖譜;牛磺豬去氧膽酸;含量測定

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2022）04-0064-06

《中國藥典》2000年版一部開始收載豬膽粉，之后的歷版藥典也均有收載[1]。2020年版《中國藥典》記載豬膽粉味苦，性寒，歸屬肝、膽、肺、大腸經;有清熱潤燥，止咳平喘，解毒的功效，主要用于頓咳，哮喘，熱病燥渴，目赤，喉痹，黃疸，泄瀉，痢疾，便秘，癰瘡腫毒的治療[2]。現代藥理學表明豬膽汁有鎮咳[3]、抗炎[4]、抑菌[5]、利膽、抗過敏[6]、抗腫瘤[7]等藥理作用，臨床上用于百日咳[8]、肝炎[9]、陰道炎[10]、肝內膽管結石[11]、腸梗阻[12]等的治療。2020年版《中國藥典》中豬膽粉的制法為取豬膽汁，濾過，干燥，粉碎，即得[2]。其“含量測定”項下規定，按干燥品計算，含牛磺豬去氧膽酸（taurohyodeoxycholic acid，1）不得少于2.0%。指紋圖譜是當今國際公認控制中藥質量的質控方法，主要用于中藥材加工、炮制等過程中的質控[13]。

本課題組檢測市售豬膽粉，發現不同廠家的各批豬膽粉質量差異大，且豬膽粉中含有膽紅素等熱敏成分。因此，本論文擬對本課題組所制備的凍干豬膽粉建立HPLC指紋圖譜，并對其含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀（含DGU-20A真空在線脫氣機，LC-20AT四元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A檢測器）

1.2 試藥 對照品1（中國藥品生物制品檢定所，含量以96.8%計，批號：111943-201802），牛磺鵝去氧膽酸（2，中國藥品生物制品檢定所，批號：110846-2010007），甘氨豬去氧膽酸（3，成都德斯特生物技術有限公司，含量：97%，批號：DST191022-136）甘氨鵝去氧膽酸（4，成都德斯特生物技術有限公司，含量：98%，批號：DSTDG017601）。豬膽購自云南省昆明市呈貢區鴻騰生豬定點屠宰場，市售5批豬膽粉分別購于昆明中藥材批發市場、上海紅花藥業、安徽亳州千草堂中藥材批發市場、陜西天璽尚品商貿有限公司、西安通澤生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Shim-pack GIST-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調pH=4.3）（B），梯度洗脫（0.01～20.00 min，29%～40%A;20.01～30.00 min，29%～29%A）;流速1.0 mL·min-1;柱溫30℃;檢測波長200 nm;進樣量5 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取1～4號對照品約2.5 mg，精密稱定，分別置5 mL的量瓶中，加甲醇溶解，定容。精密移取各上述4種母液1 mL置同一個5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 um濾膜濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 凍干豬膽粉供試品溶液的制備 取凍干豬膽粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 um濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3.2 市售豬膽粉供試品溶液的制備 取市售豬膽粉約0.5 g，精密稱定，按照“2.4.1”進行制備，即得。

2.4 凍干豬膽粉HPLC指紋圖譜

2.4.1 精密度、重復性、穩定性試驗 取凍干豬膽粉供試品溶液按上述色譜條件下進樣，分析測定連續進樣6次，以3（峰7）為參照峰（S），計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.1%，相對峰面積RSD<3.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

取同批號凍干豬膽粉6份，按2.4.1項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，以3（峰7）為參照峰（S），計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.1%，相對峰面積RSD<3.6%（n=6），表明本試驗方法重復性良好。

取供試品溶液分別在0、4、8、12、24、36h，按上述色譜條件下進行分析檢測，以3（峰7）為參照峰（S），計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.41%，相對峰面積RSD<4.8%（n=6），說明供試品溶液在36 h內穩定。

2.4.2 指紋圖譜的建立及共有峰的標定 分別取對照品1至4號按對照品適量，精密稱定，制成混合標準溶液。10批自制凍干豬膽粉按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進樣。通過對照品保留時間分別標定1（峰5）、3（峰7）、2（峰10）、4（峰11）。將各批供試品的色譜圖以AIA格式導入中國藥典推薦中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），剪切前5 min溶劑峰，選定S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，中位數法進行多點校正生成對照圖譜R，10批自制凍干豬膽粉供試品溶液確定11個色譜峰為共有峰。

2.4.3 指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行數據（2012版）”處理，以系統生成的參照圖譜為對照圖譜，計算10批凍干豬膽粉的相似度，結果見表1，數據表明10批凍干豬膽粉相似度均大于0.98。選峰面積最大3標記為S峰，計算其他共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結果分別見表2、表3。

2.4.4 市售豬膽粉的相似度評價 5批市售豬膽粉按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進行測定。將5批供試品的色譜圖以AIA格式導入中國藥典推薦中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版），剪切前5 min溶劑峰，選定上述10批凍干豬膽粉生成的對照圖譜R為參照圖圖譜，時間窗寬度為0.1，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行數據處理，計算相似度，結果見表4，5批市售豬膽粉的指紋圖譜僅有1批相似度大于0.95，其余4批均不符合規定。

2.5 凍干豬膽粉和市售豬膽粉含量測定

2.5.1 標準曲線的制備 分別配制濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg·mL-1的1溶液，在含量測定項下色譜條件進樣分析。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，1的標準曲線方程為Y=2×106X-1550.1，r=1。

2.5.2 精密度、重復性、穩定性試驗 取凍干豬膽粉供試品溶液按上述色譜條件下進行分析測定連續進樣6次，1峰面積RSD<0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

取同批號凍干豬膽粉6份，按供試品溶液制備，在上述色譜條件下進行分析測定，1峰面積RSD<1.3%（n=6），表明本試驗方法重復性良好。

取凍干豬膽粉供試品溶液別在0、1、2、4、8、12、24、36 h，按上述色譜條件下進行分析檢測，36 h內1峰面積RSD<1.0%（n=8）。說明供試品溶液在36 h內穩定。

2.5.3 加樣回收試驗 精密稱取凍干豬膽粉適量，按供試品溶液進行制備，制成5 mg·mL-1凍干豬膽粉溶液。精密稱取1對照品適量，加甲醇制成0.26 mg·mL-1的1溶液，取凍干豬膽粉溶液、1溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻取適量過0.22 um微孔濾膜，按“2.2”項下色譜條件進行分析，結果顯示平均回收率為101.47%，RSD（n=6）為0.68%。

2.5.4 樣品含量測定 取上述10批凍干豬膽粉和5批市售豬膽粉按供試品溶液，在上述色譜條件下進行含量測定，10批凍干豬膽粉中1的平均含量為（5.56±6.33）%，5批市售豬膽粉中1的平均含量為（0.99±132.32）%，僅1批符合規定。

3 討論

指紋圖譜的色譜條件的建立：分別按《中國藥典》2020年版第一部豬膽粉含量測定項下甲醇-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（70∶30）（用磷酸調節pH值為4.4）和文獻[15]乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉（磷酸調pH4.4）梯度洗脫（0.01～40.00 min：28%～36%乙腈;40.01～50 min：28%～28%乙腈）兩個流動相系統，發現文獻[15]梯度洗脫的圖譜出峰較多，峰形好，分離度較佳，僅存在少部分峰重疊的問題。進一步考相緩沖鹽溶液的pH值、柱溫、進樣量和梯度洗脫條件，篩選出最佳方案，即以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（磷酸調節pH4.3）為流動相，梯度洗脫（0.01～40 min：乙腈29%～40%;20.01～30 min：29%～29%），能分離出11個凍干豬膽粉色譜峰，較文獻[15]的色譜條件多分離出4個峰，且測定時間短。

在本色譜條件下利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統建了由11個共有峰組成的凍干豬膽粉指紋圖譜，10批凍干豬膽粉樣品的指紋圖譜相似度高于0.995，規定5分鐘后的色譜峰相似度不得低于0.95，10凍干豬膽粉樣品的指紋圖譜均符合規定;5批市售豬膽粉的指紋圖譜僅有1相似度符合規定。

在本色譜條件下測定1的含量，10批凍干豬膽粉1的平均含量為5.56%±6.33%，均符合藥典標準;而市售豬膽粉5批中僅有1批符合規定。

4 結論

采用冷凍干燥技術成功制得凍干豬膽粉，得到的凍干豬膽粉顏色鮮黃、潔凈。篩選的色譜條件可作為凍干豬膽粉和豬膽粉指紋圖譜和含量測定的色譜條件，用于測定的凍干豬膽粉和市售豬膽粉。5批市售豬膽粉只有1批的指紋圖譜相似度和含量測定結果符合規定，還需進一步購買和測定市售豬膽粉的質量，找出市售豬膽粉質量不符合規定的原因。

綜上，凍干技術可用于生產優質豬膽粉，可作為制備豬膽粉的新技術。

參考文獻：

[1]石巖，魏鋒，馬雙成，等.豬膽藥用研究進展及質量控制概況[J].中國中藥雜志，2018，43（4）：637-644.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2020年版（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2020：319.

[3]李澤浩.豬膽汁酸的藥理作用研究（Ⅱ）——豬膽汁酸鎮咳作用的初步觀察[J].杭州師范學院學報，1992（6）：64-67.

[4]張程，郝滿良.豬膽粉抗炎作用研究[J].河北農業大學學報，2018，41（2）：89-93.

[5]李澤浩.豬膽汁酸組份的藥理作用研究（Ⅰ）-豬膽汁酸的抑菌作用[J].杭州師范學院學報（自然科學版），1991（6）：78-82.

[6]索娟等，冼彥芳，黃曉丹，等.精制藿膽方抗過敏藥理作用研究[J].中國實驗方劑學雜志，2007（9）：47-49.

[7]劉琦，劉春敏，孟奎，等.膽酸鈉對人卵巢癌細胞系作用的研究[J].中國實用婦科與產科雜志，2004（11）：22-24.

[8]荊向榮.豬膽汁保留灌腸治療百日咳六十七例[J].浙江中醫雜志，1997（2）：84.

[9]劉宏進.豬膽汁的幾種妙用[J].中國民間療法，2011，19（2）：32.

[10]黃艷萍.一種用于治療婦科陰道炎的豬膽粉的制備工藝[P].山東省：CN110882275A，2020-03-17.

[11]貝時英，章偉平.豬膽消石散治療肝內膽管結石54例[J].實用中醫內科雜志，2000（2）：33.

[12]張聘泉.豬膽汁佐治先天性巨結腸24例[J].實用兒科臨床雜志，1990（4）：58-59.

[13] Lu H，LiangY，WuX，et al.Tentative Fingerprint-Efficacy Study of Houttuynia cordata Injection in Quality Control of Traditional Chinese Medicine[J].Chemical & pharmaceutical bulletin，2006，54（5）：725-730.

[14]陳士朋，姜健，光斌熊，等.從豬膽中提取膽紅素的研究[J].江西化工，2018（5）：116-117.

[15]杜梓萱，郭琳，黃平情，等.高效液相色譜法同時測定豬膽粉中4種結合型膽酸含量及其特征圖譜研究[J].中南藥學，2019，17（6）：880-885.

（收稿日期：2022-01-26）