Sigma-1受體激動劑PRE-084對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

王 瑞，張玲葉，杜艷華

(廣東省深圳市龍華區人民醫院心內科，廣東 深圳 518109)

急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)再灌注治療后心肌的缺血再灌注損傷，不同程度抵銷了灌注治療作用[1-3]。Sigma-1受體(Sigma-1 receptor,Sig-1R)應用于心肌疾病患者中具顯著保護心肌作用[4-5]。新型選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)如舍曲林、氟伏沙明具備很強的Sigma-1受體激動效果[6-7]。在改善抑郁癥狀的同時對心臟具備防護效果[8]，主要用于心血管疾病與抑郁的治療。筆者前期研究提示PRE-084降低心肌缺血后灌注損所傷引起細胞調亡，其機制與激活Akt / eNOS信號通路有關[9]。本研究通過大鼠建立在體缺血后灌注損傷模型觀察大鼠缺血再灌注損傷應用PRE-084對心肌梗死范及效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑

1.1.1實驗動物 選用24只重量在220～250 g的SD雄性大鼠(動物合格證號：SCXK鄂2015-0018)由武漢大學動物實驗中心提供為研究對象，其均為SPF級。

1.1.2試劑盒 試劑盒均為購自南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)測試試劑盒、丙二醛(monochrome display adapter，MDA)測試試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測試試劑盒及肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)測定試劑盒。

1.2實驗分組 將24只大鼠采用電腦進行隨機分組，PRE-084組(8只)、假手術組(8只)以及缺血后灌注組(8只)，其中缺血后灌注組與假手術組術前輸入生理鹽水，PRE-084組輸入同量的1 mg/kg PRE-084，假手術組不結扎只穿線。實驗在武漢大學人民醫院心血管211實驗室完成。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型制作及樣本獲取 大鼠術前12 h禁食。簡要操作方法為：將10%水合氯醛依據3 mL/kg的比例進行麻醉注射，在實驗大鼠氣管插管后，將其與動物呼吸機鏈接并設頻率為60次/min，潮氣量設置為50 g/mL，在胸骨左側開，用細小彎針在冠狀動脈左前降支中上1/3處穿線(6/0號)，穿雙線(一根用于尹文思蘭染色前結扎)。以肉眼可見結扎點的肉眼觀察到遠端心前壁變紫或蒼白，結扎后進行心電圖ST段變化情況的評估，將其中無變化者淘汰，于缺血30 min之后，松開結扎線，觀察約10 min后逐層縫合，連續觀測心電圖30 min。

1.3.2大鼠心功能的監測 再灌注24 h后再次以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定四肢與頭，雙上肢和雙下肢皮下依次鏈接針形心電圖電極，觀察并記錄Ⅱ導聯心電圖情況。采用酒精對頸、胸部進行消毒后，剪除頸前縫線，輕輕分離頸前肌后可見氣管，再次插管；將右側頸部肌進行分離，暴露頸動脈后結扎遠心端，近端用小動脈夾夾閉；在動脈上剪一“V”字形口，用聚乙烯導管插入切口，松開動脈夾，小心推送導管，使導管緩慢經過右側頸總動脈最后進左心室，將血管與導管用線結扎，固定導管。壓力換能器連接生物信號分析系統，記錄心臟壓力曲線。記錄保存2 min的左心室壓力曲線。根據壓力曲線分析(Biopac system軟件)左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(+dp/dtmax)及等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dtmax)，心率(heart rate，HR)。

1.3.3CK-MB 心功能檢測完成后分離一側股靜脈，先從股靜脈取血1 mL用于查血清CK-MB。

1.3.4心肌梗死面積測定 取血完成后再次插管；接呼吸機。剪開胸壁，用前1 d預留的線再次結扎冠狀動脈，從股靜脈注入1%伊文思藍2 mL, 可以讓非缺血區心肌藍染。然后取之心臟，沖洗后祛除心房心室，在-80 ℃冰箱冰凍20 min后取出，將其切成4～6塊1.5 mm心肌片,其放在37 ℃的2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC溶液中15 min，將活的心肌組織染成磚紅色。依次用濾紙將切片吸干水分后進行稱重。雙面彩色拍照。根據心肌厚片表面的3種顏色, 用Photoshop7.0和計算不規則多邊形面積軟件分別測定雙面梗死區面積和缺血區面積占整片心肌切面的百分比。

1.4心肌SOD、MDA測定 心肌梗死面積測定完成后行留取缺血區心肌，采用冰生理鹽水進行處理,并以濾紙吸干后進行稱重, 低溫勻漿離心,吸取上清測定MDA含量和 SOD活性 。

1.5統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PRE-084對缺血再灌注對大鼠血清CK-MB、SOD及MDA的影響的影響 再灌注結束后檢測各組CK-MB，結果顯示，I/R組、PRE-084組的CK-MB值和MDA值均高于Sham組，SOD值低于Sham組，PRE-084組的CK-MB值和MDA值均均低于I/R組，SOD值高于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 PRE-084對缺血再灌注大鼠CK-MB、SOD、MDA的影響Table 1 Effect of PRE-084 on CK-MB, SOD and MDA in ischemia-reperfusion rats

2.2PRE-084對血流動力學的影響 再灌注24 h后，與Sham組相比，PRE-084組及I/R組+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP明顯下降,與I/R組相比，PRE-084組明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)；與Sham組相比，PRE-084組及I/R組LVEDP升高，差異有統計學意義(P<0.05)，I/R組和PRE-084組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 PRE-084對血流動力學的影響Table 2 Effects of PRE-084 on hemodynamics

2.3PRE-084對心肌梗死面積的影響 I/R組與PRE-084組缺血區占左心室面積分別為(0.45±0.08)mm2和 (0.45±0.09)mm2，差異無統計學意義(t=0.000，P=1.000)。兩組的心肌梗死范圍分別為(0.49±0.10)%和(0.35±0.09)%，兩組比較差異無統計學意義(t=2.943，P=0.054)。

3 討 論

急性心肌梗死病死率和致殘率高，盡早進行心肌再灌注治療可以降低病死率，改善患者心功能，是最佳治療方案。然而部分患者的缺血心肌在恢復血液灌注后，因氧化應激等引起組織細胞損傷,可導致心肌梗死面積擴大情況的發生，且心功能呈現降低的趨勢，并可出現再灌注性心律失常等異常情況。心肌缺血后灌注損傷降低了再灌注治療作用。近年來心肌缺血/再灌注損傷的發生機制是臨床研究的重點與熱點之一。本前期研究提示Sigma-1受體激動劑PRE-084可通過激活Akt/eNOS信號通路降低心肌缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡，提示Sigma-1受體激動劑PRE-084可能具有降低心肌梗死面積，并有助于改善心功能，其機制除了降低細胞凋亡外，還可對氧自由基產生產生影響，顯著提升其對氧自由基的清除能力。

缺血再灌注的前數分鐘，能經過多種途徑產生大量活性氧[10]。相關學者用同位素方法證實心肌缺血及其后的再灌注過程中有活性氧的形成[11]，之后臨床研究發現抗氧自由基治療具有心肌保護作用[12-13]。MDA是I/R損傷中自由基所誘導脂質過氧化反應產物之一[14]。其可導致細胞膜受損，出現細胞膜結構和功能等方面的損傷[15]。因此MDA對于體內脂質過氧化反應具有一定的反應作用，間接地反映細胞損傷的程度。本研究顯示，PRE-084治療組MDA下降，提示對心肌保護作用與降低氧自由其損傷有關。體內自由基的清除通過SOD實現，SOD是過氧化物酶，能夠還原過氧化物，減少活性氧簇的生成。超氧化物可快速, 自發歧化為過氧化氫, 在SOD作用下這種轉化可加速約1萬倍，這種快速轉換有效地防止了O2-與其他生物分子在細胞中的反應。本研究顯示缺血后灌注使SOD顯著下降，降低了氧自由基清除能力，而PRE-084治療組SOD上升，提示PRE-084治療增加機體對氧自由基的清除能力。

本研究提示再灌注24 h后，經PRE-084預處理，心肌梗死后心肌細胞膜受損時，可導致其細胞內釋放，并進入血液中，因此其在血液中的表達水平有助于了解心肌的受損程度。同時，PRE-084治療組心臟功能顯著升高，提示PRE-084治療降低心肌缺血再灌注心肌損傷。

綜上所述，PRE-084預處理減少心肌梗死后心肌損傷作用機制可能與Sigma-1受體激動劑PRE-084可激活的Akt/eNOS信號通路降低心肌缺血再灌注損傷，及降低氧自由基損傷等有關。