枯草芽胞桿菌高細胞密度發酵優化

戴 航， 丁 躍， 陳 雄， 王 志

(1 湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2 湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心， 湖北 武漢 430068；3 湖北工業大學工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068)

益生菌是一類定植于動物腸道、能夠對宿主產生健康功效的有益活性微生物，其作用機制大致分為四類：增強腸道黏膜屏障功能[1]、阻止病原菌的黏附[2]和定植[3]、增強系統的免疫反應[4]、分泌物質[5]和改變腸道環境[6]。枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)發酵能夠產α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶等十幾種酶[7]，是被允許作為動物飼料添加劑的益生菌菌種[8-10]。因其芽胞具有極強的抗逆性，常被加工成芽胞菌粉以便運輸和保存。采用高密度發酵技術大規模培養非遺傳修飾菌是枯草芽胞桿菌工業生產的常用方式，而達到高密度發酵的一般標準是芽胞數達到200億個/mL的水平。

微生物生長繁殖過程復雜，受到內外部條件共同影響[11-14]。培養基作為微生物生長代謝的營養基質，其組成成分和比例對細胞生長存在很大影響。趙達等[15]通過搖瓶發酵培養基優化，確定在3%玉米淀粉、6%豆粕等培養物下，發酵60～66 h，B.subtilisB03生物量達到105.7×108CFU/mL；陳俊煌[16]優化B.subtilisHS-09發酵培養基發現，使用復合氮源能顯著提高菌落總數，在最適發酵培養基下用200 L發酵罐放大試驗，有效活菌數達4.3×109CFU/mL，芽胞率90%；朱曉立等[17]研究了B.subtilisB53在前期碳限制條件下(0.4%玉米淀粉、0.2%葡萄糖)結合流加葡萄糖的補料策略，30 L罐培養26 h，芽胞數最高能達到110億個/mL。

在枯草芽胞桿菌工業生產發酵培養基中，碳氮源是主要的組成部分，其中玉米淀粉、豆粕和蛋白胨的價格是影響發酵成本的主要因素。通過發酵培養基優化確定其比例對菌體生長效率的影響尤為重要。而發酵溫度不僅影響酶活性，還影響發酵液的物理特性，從而對菌體產生影響[18]。Hecker等[19]發現熱激能夠誘導RelA蛋白的合成，促發嚴謹反應。而芽胞生成本身就是細胞對逆境應激的策略之一[20]。因此適宜的碳氮比和發酵條件以及一定的逆境條件可能會促進芽胞的生成。

基于以上分析，本研究首先在30 L罐上采用分批發酵方式探討不同發酵策略對枯草芽胞桿菌生長的影響，確立了一種有效的發酵方法，為枯草芽胞桿菌的工業化生產提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽胞桿菌HT-03(BacillussubtilisHT-03,HT-03菌株)，由發酵工程教育部重點實驗室保存。

1.2 培養基

斜面培養基：酵母浸膏20 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 5 g/L,調pH 7.5±0.1，123℃滅菌30 min；活菌數測定(平板計數)培養基同上。

30 L罐基礎(對照)培養基配方為搖瓶正交實驗優化后所得配方(g/L)：玉米淀粉30，豆粕60，葡萄糖5，酵母浸粉3，蛋白胨3，輕質碳酸鈣3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2，K2HPO4·3H2O 2，MnSO4·H2O 0.3。

1.3 培養方法

1.3.1種子活化從-80 ℃冰箱的甘油管轉接試管斜面，37℃培養36 h。

1.3.2種子制備向新鮮試管斜面加入無菌水，制備菌懸液，后80℃水浴10 min，備用接種，接種量為10 mL，菌體濃度為20×108CFU/mL。

1.3.3 30L罐分批發酵培養發酵體積按罐容積的60%(18 L)計，121℃，滅菌30 min。

發酵條件：恒溫35℃，起始轉速500 r/min，通風量1.0 m3/h，發酵8 h轉速和通風量調至800 r/min、2.5 m3/h，發酵24 h轉速和通風量調至500 r/min、1.5 m3/h，發酵30 h轉速和通風量調至300 r/min、1.0 m3/h。整個發酵周期罐壓維持在0.04～0.05 MPa。

1.3.4 30L罐發酵策略如表1所示。

表1 發酵策略設計

1.4 檢測方法

1.4.1活菌數的測定發酵液活菌數(CFU/mL)采用稀釋涂布平板法[21]，每間隔3 h周期取樣檢測。

1.4.2芽胞數的測定適當稀釋的菌液經80℃水浴15 min，后進行平板涂布。

1.5 數據處理

實驗數據至少是3組平行實驗的均值，通過Origin 9.0對實驗數據進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 枯草芽胞桿菌在發酵策略1下的生長情況

在發酵策略1下細胞生長情況如圖1所示：18～24 h菌體對數生長，其平均比生長速率μ=0.062 h-1[14]，24 h生物量達到157×108CFU/mL，芽胞155億個/mL。

圖 1 枯草芽胞桿菌在發酵策略1下的生長情況

由于芽胞桿菌對數生長會發生溢流代謝而產酸，所以pH逐漸下降，而后菌體可以利用溢流的有機酸作碳源進行二次生長[22]，再加上基質中氨基酸的消耗，因而pH從18 h的7.99持續回升至8.78(42 h)。

18～24 h溶氧(DO)持續回升至77.9%， 此時降低轉速至500 r/min、 通風量至1.0 m3/h， DO降至最低值53.8% (30 h) 后快速上升。 30～42 h生物量略有增加，但μ僅有0.011 h-1。 雖然42 h生物量達到177×108CFU/mL， 但芽胞數(163億個/mL)較30 h(155.8億個/mL)只提高4.6%。說明：發酵后期(30 h之后)基質營養不足以滿足菌體生長的需求，并引起細胞耗氧大幅下降，使DO于42 h回升至86.3%。由于30 h后碳源、氮源等營養基質不能滿足菌體大量生長所需，所以生物量和芽胞數均不高，因此接下來可考慮調整碳氮源的比例來考察菌體的生長情況。

2.2 策略2對枯草芽胞桿菌生長的影響

在發酵條件、培養基其他成分不變的基礎上，僅將基料中的玉米淀粉和豆粕分別提高到4%和8%形成策略2，菌體生長代謝情況如圖2所示：

圖 2 策略2對枯草芽胞桿菌生長的影響

18～24 h生物量從210×108CFU/mL增長到274×108CFU/mL，雖然其μ為0.044 h-1，比策略1低29%(這可能是由于對數前期菌體迅速生長所產生的代謝產物對后期生長有一定抑制作用)，但其24 h的生物量較策略1提高74.5%。

與策略1相似的是：pH從18 h(7.85)上升至發酵結束(8.89)，不同的是：24 h以后生物量和芽胞還在持續增加，說明：增加碳源、氮源的用量能夠延長細胞生長周期，提高生物量和芽胞數。芽胞從21 h的185億個/mL增加到30 h的312億個/mL，較發酵策略1下30 h的芽胞數提高100.3%。

18～24 h溶氧持續回升至67.5%，降低轉速和通風量后，溶氧基本維持穩定，30 h后開始上升至發酵終點91.3%。雖然30～42 h芽胞數有所提高，但培養12 h只提高了4.8%，42 h后維持穩定。因此在策略2條件下可考慮發酵終點選在第30 h。

雖然30 h芽胞數達到312億個/mL，但由于基料濃度高，導致發酵液粘度增大，不僅使成本升高，而且對發酵下游加工處理帶來較大困難。因此，考慮減少配方用料，考察菌體的生長情況。

2.3 策略3對枯草芽胞桿菌生長的影響

豆粕用量降至5%(發酵策略3)菌體生長情況如圖3所示。

圖 3 策略3對枯草芽胞桿菌生長的影響

18～33 h的生物量一直在增加，但30 h僅有119×108CFU/mL，較發酵策略2下30 h的生物量(315×108CFU/mL)減少近62%、較發酵策略1減少24%。33 h生物量達到峰值130×108CFU/mL后有略微下降。18～33 h菌體平均生長速率為6.33×108CFU·(mL·h)-1較策略2下18～30 h的平均生長速率(8.75×108CFU·(mL·h)-1)下降27.7%。18 h以后pH持續回升，但pH均低于發酵策略1和2，36 h取樣結束時的pH為7.92。

18～24 h溶氧緩慢上升，24 h降低轉速和通風量后，溶氧上升較快，這與菌體生長速率逐漸減小的趨勢保持一致。

另外，24 h之前幾乎還未形成芽胞，且30 h的芽胞數僅有94億個/mL，較策略1和2減少40%、70%。33 h芽胞數達到108億個/mL，此時芽孢率也僅有83%。相較于策略1，雖然玉米淀粉由3%增加至4%，但豆粕由6%減少至5%，生物量和芽胞數都有所下降，這可能是由于氮源對枯草芽胞桿菌后期的生長和芽胞生成影響較大。相較于策略2，由于培養基中豆粕減少了37.5%，所以可供菌體用于生長繁殖和形成芽胞所需的氮源大量減少，不足以維持菌體高密度發酵以及有效生成芽胞。

2.4 策略4對枯草芽胞桿菌生長的影響

既然豆粕減少至5%不能滿足高密度發酵所需的條件，那么接下來可考慮微調其他氮源的用量來考察其對菌體生長的影響。

在策略3的基礎上，將蛋白胨的用量從0.5%增加到0.8%形成策略4。菌體生長情況如圖4所示：18～36 h生物量從122×108CFU/mL持續上升至252×108CFU/mL，平均生長速率為7.22×108CFU·(mL·h)-1，36 h后有略微增加。36 h的芽胞數(198億個/mL)較策略3提高近82%，42 h芽胞數達到210億個/mL，較策略1(163億個/mL)提高29%。

圖 4 策略4對枯草芽胞桿菌生長的影響

與策略3一樣，18 h之后pH持續回升，但pH值均高于策略3，發酵終點45 h的pH為8.91。24 h調低轉速和通風量后，溶氧維持在30%左右，這可能是由于菌體還在緩慢生長，因此6 h之內耗氧和溶氧速率基本相等，二者處于動態平衡。

蛋白胨中含有豐富的蛋白質、氨基酸、生長因子和微量元素等營養成分。微調增加了0.3%后，菌體生長速率較策略3有明顯提高，且芽胞數高于策略3。

2.5 策略5對枯草芽胞桿菌生長的影響

將策略4中玉米淀粉和豆粕的用量從4%、 5%分別降低到3.5%、 4%形成策略5。 菌體生長情況如圖5所示：18 h的pH值為7.43與策略4相近， 但與策略4不同的是， 30 h之前回升較快， 與溶氧變化趨勢一致， 這可能是由于溢流的有機酸較少， 消耗較快， 到后期營養不足， 菌體生長變緩。 雖然18 h的生物量(94×108CFU/mL)只有策略4的77%， 但42 h生物量(236×108CFU/mL)較策略4只減少10%。42 h芽胞數較策略4僅減少6.7%，較策略1提高20.2%。策略4的36 h芽胞數為 198億個/mL， 而策略5發酵42 h芽胞也能達到 196億個/mL，只是發酵周期較策略4延長了6 h。因而需要考慮采用工藝參數優化來縮短發酵周期。

圖 5 策略5對枯草芽胞桿菌生長的影響

2.6 策略6對枯草芽胞桿菌生長的影響

基于策略5，發酵24 h將溫度從35℃升至40℃形成策略6，考察一定的逆境條件對細胞生長情況的影響(圖6)：18～24 h生長情況如策略5基本一致，18 h的pH值7.37，后持續上升至發酵結束(42 h)為8.65，略微低于策略5。24 h升溫后，雖然27 h生物量只比策略5高5.2%，但此時芽胞數(82億個/mL)較策略5提高了46.4%。同時，芽胞率也比策略5提高了39%。36 h芽胞達208億個/mL，較策略5提高42.5%。發酵24 h降低轉速和通風量后溶氧依然在上升，這可能是由于菌體進入對數生長后期，胞內能量代謝水平降低，對溶氧需求逐漸下降造成。

圖 6 策略6對枯草芽胞桿菌生長的影響

以上數據表明：策略6芽胞數達到200億個/mL左右用時(36 h)比策略5減少近15%，與策略4接近，但其碳、氮源較策略4分別下降12.5%、20%，生產成本顯著降低。

2.7 不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響

不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響如表2所示。

升溫能促進芽胞生成效率，但對細胞生長沒有促進效果(策略6和策略5)。策略1發酵42 h生物量為177×108CFU/mL，未達到高密度最低要求。即使升溫縮短了芽胞生成周期、提高了芽胞率，仍不能達到高密度發酵水平(芽胞數200億個/mL)，因此未研究策略1下升溫處理對細胞生長代謝的影響。

策略2枯草芽胞桿菌生物量和芽胞數最高，24 h芽胞數就已達到251億個/mL，但在此條件下成本較高。策略3生物量和芽胞數最低，36 h芽胞數僅有109億個/mL。策略4發酵36 h芽胞數達到198億個/mL，將策略4中的玉米淀粉和豆粕分別降低0.5%和1%(策略5)發酵42 h芽胞數達到196億個/mL，雖然周期延長了6 h，但碳氮源分別減少了12.5%和20%，發酵成本降低。在策略5基礎上，24 h將發酵溫度從35℃升至40℃，發酵36 h芽胞數達到208億個/mL，與策略4相近。

另外，策略6發酵36 h，細胞數達217×108CFU/mL，芽胞數208億個/mL，其發酵效率相比趙達等[15]、陳俊煌[16]、朱曉立等[17]的報道顯著提高。

表2 不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響

3 結論

枯草芽胞桿菌高密度發酵中，培養基和發酵條件對細胞生長和芽胞生成具有很重要的影響。本研究在已確定搖瓶水平最適發酵培養基以及發酵溫度的基礎上，進一步通過優化發酵策略確定了30 L罐分批發酵工藝參數：玉米淀粉35 g·L-1， 豆粕40 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，酵母浸粉3 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，輕質碳酸鈣3 g·L-1，七水硫酸鎂0.5 g·L-1，氯化鈉2 g·L-1，三水磷酸氫二鉀2 g·L-1，一水硫酸錳0.3 g·L-1，發酵24 h溫度從35℃升至40℃。發酵36 h，細胞數達217×108CFU/mL，芽胞數208億個/mL，較優化前分別提高28.4%、31.6%，實現了低成本培養基配方條件下的高芽胞率高密度發酵，為枯草芽胞桿菌工業化生產穩定芽胞率提供了重要參考。

另外，細胞是否開始形成芽胞是由內外環境條件共同決定的，與調控因子Spo0A含量和其磷酸化水平有關[23]。由于枯草芽胞桿菌呼吸代謝過程存在氧化應激[24]，而氧化應激會對電子傳遞鏈造成損傷，影響細胞的能量供應效率[25-26]。進而可能會對芽胞生成效率產生影響，因而該領域的研究有待進一步展開。