以MRP2/MRP3轉運體為作用靶點的何首烏中肝毒性成分篩選△

汪祺，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.P.M.的干燥塊根，自古以來是歷代醫家廣為推崇的補益藥和抗衰老藥，具有補肝腎、益精血、烏須發的功效[1]，臨床應用較廣。隨著何首烏及其制劑在臨床的長期應用，其引發的不良反應引起了關注，特別是有關何首烏致肝損傷的報道層出不窮，相關不良反應報告超過2 萬份[2-5]。何首烏引起的藥源性肝損傷位居全部中藥肝損害病例數量第1 位[6]。2014 年，原國家食品藥品監督管理總局發布了何首烏及其相關制劑可引發肝損傷的預警。因此，闡釋何首烏導致肝損傷的具體作用機制和作用靶點、進一步明確其肝毒性成分成為急需解決的問題。

各種原因引發的膽汁酸代謝障礙或膽紅素代謝受阻可引發膽汁淤積，繼發肝損傷。因此，膽汁淤積的發生與體內膽汁酸、膽紅素代謝通路中多種轉運蛋白密切相關，如多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistance associated protein 2，MRP2）和MRP3等[7]。MRP2 在體內主要負責膽酸鹽的排泄，同時介導膽紅素及其葡萄糖醛酸結合物排入膽汁，其高表達于肝臟、腸及腎臟組織。MRP3 則主要將膽酸鹽從肝細胞轉運到血竇，為基底側外排的代償途徑。研究表明，MRP2、MRP3 蛋白功能受到影響時肝臟表現出不同程度的膽汁酸或膽紅素淤積，繼而產生毒性反應[8]。有研究表明，由于MRP2、MRP3 為膽紅素及膽汁酸主要外排轉運體，當兩者受阻時，可引發膽紅素和膽汁酸代謝循環障礙，繼而淤積產生肝毒性，而上述表現與何首烏及其制劑臨床引發的肝損傷癥狀極為相似，均為黃疸及膽汁淤積[9-10]。

基于此，本課題組推測何首烏引發的肝損傷與其作用于外排轉運體MRP2、MRP3 高度相關。因此，本研究以MRP2、MRP3為切入點，結合體外計算機分子對接技術和肝細胞毒性實驗，篩選何首烏中潛在的肝毒性化合物。

1 材料

1.1 細胞

人源肝細胞HepaRG 購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 試藥

胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）均購自Gibco公司；DuRed核酸染料（北京富百科生物技術有限公司）；Real SYBR Mixture、瓊脂糖均購自Spain Biowest 公司；2×TaqPCR MasterMix、總RNA 提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、D2000 DNA Marker 均購自北京厚生博泰生物技術有限公司；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（反式二苯乙烯苷，批號：110844-201915，純度：90.7%）、大黃素（批號：110756-201913，純度：96.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：B20773，純度＞98.0%）、膽紅素（批號：B20273，純度＞98.0%）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：B20241，純度＞98.0%）均購自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）。

1.3 儀器

Line Gene 9620 型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測系統FQD-96A 型基因擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）；EDC-810型PCR儀（北京東勝創新生物科技有限公司）；Nano-100 型分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）；VICTOR X5 型多功能酶標儀（PerkinElmer 公司）；LEGEND MICRO17 R 型臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific公司）；Vortex-Genie 2 型渦旋振蕩器（Scientific Industries 公司）；GravityPlus?、GravityTRAP?型滴板（Insphero公司）。

2 方法

2.1 分子對接

選擇48 個何首烏中所含的主要單體成分（化合物主要來源于文獻報道[11-13]及中國天然產物化學成分數據庫，包括二苯乙烯苷類、蒽醌類、蒽酮類等）進行對接測定。首先采用Discovery Studio 2.5 功能模塊對上述單體分子進行預處理，預處理過程主要包括三維結構的生成、結構的優化、刪除重復的結構等，最終得到48 個化合物的化學結構；其次，基于生成的結構構建配體庫，以此為基礎進行后續虛擬篩選[14-15]。

以“MRP2”“MRP3”為關鍵詞檢索SWISSMODEL 數據庫（https://swissmodel.expasy.org/），根據篩選規則獲得1 個同源模建結構，MRP2 及MRP3模板的PDB 編號為6uy0。根據文獻記錄的氨基酸殘基定義活性位點[16-17]，MRP2 半徑為1.742 387 nm，位點的三維坐標位置為157.158 707、176.372 707、163.243 586，關鍵氨基酸殘基為LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261；MRP3 的半徑為1.517 338 nm，位點的三維坐標位置為171.206 066，173.948 148，165.653 377，關鍵氨基酸殘基為GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245。選擇以MRP2、MRP3 為主要轉運蛋白并具有肝毒性的膽紅素作為底物進行初步對接模型驗證[18-20]。

2.2 肝細胞毒性考察

于96 孔板中每孔接種對數生長期的HepaRG 細胞約5000 個（密度為5×104個/mL），孵育24 h 后給予待測單體。實驗設置空白對照組（不含HepaRG細胞）、對照組（0.5%DMSO）、陽性對照組（膽紅素）及不同質量濃度的待測單體給藥組（反式二苯乙烯苷為15、40、150、400 μg·mL-1，大黃素為15、40、150、400 μg·mL-1，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為15、30、150、400 μg·mL-1，蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為1、3、10、30 μg·mL-1）。將孵育體系置于37 ℃、5%CO2條件下24 h。每孔加入細胞活力檢測試劑（CCK-8細胞計數試劑盒）10 μL，37 ℃避光孵育2 h后采用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的吸光度（A）。按照公式（1）計算細胞存活率[21]，并根據細胞活率計算半數抑制濃度（IC50）[14-15]。

2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗

HepaRG 細胞分別與0.1、1.0、10.0 μmol·L-1目標化合物（蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、反式二苯乙烯苷和大黃素）作用24 h后，每組收集不少于1×106個細胞用于qRTPCR 檢測，考察其對HepaRG 細胞中MRP2、MRP3 mRNA 表達水平的影響。平行設置對照組（0.5%DMSO）。MRP2、MRP3 mRNA 的表達量以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，進行相對定量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列相關信息見表1。樣本總RNA 經通用型總RNA 提取試劑盒提取，RNA 質量濃度和純度采用Nano-100型分光光度計測定。用cDNA 第一鏈合成試劑盒進行cDNA 反轉錄，并進行qRT-PCR 檢測[14-15,22-23]。PCR反應條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循環40次）。

表1 qRT-PCR實驗引物序列

3 結果

3.1 分子對接實驗結果

MRP2、MRP3 蛋白結構見圖1，與膽紅素對接打分值分別為156.977、153.491。48 個待測單體化合物對接結果見表2～3（25 個目標化合物無法與MRP3 結合，34 個目標化合物無法與MRP2 結合）。以具有肝毒性的MRP2、MRP3 底物膽紅素作為參照，選取其打分值的80%作為參照[23-25]，規定潛在肝毒性化合物得分應不低于125.582（MRP2）和122.793（MRP3）。與MRP2 對接結果顯示，大黃素-6-O-β-D-葡萄糖苷，大黃素甲醚-8-O-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷、反式二苯乙烯苷打分值高于膽紅素打分值的80%，可被初步認定為潛在毒性成分；與MRP3對接結果顯示，大黃素-6-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等打分值均高于膽紅素打分值的80%，可被初步認定為潛在毒性成分。

圖1 MRP2、MRP3蛋白結構

表2 何首烏成分與MRP2對接結果

3.2 肝細胞毒性考察結果

根據對接得分，選取何首烏中具有代表性且含量較高的單體反式二苯乙烯苷、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素進行體外細胞毒性考察。由實驗結果（圖2）可知，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（IC50為21.37 μg·mL-1）和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（IC50為6.96 μg·mL-1）表現出較明顯的肝細胞毒性作用；反式二苯乙烯苷表現出中等肝細胞毒性作用（IC50為42.77 μg·mL-1）；大黃素（IC50為62.81 μg·mL-1）肝細胞毒性作用相對最小。體外肝細胞毒性實驗結果與分子對接打分值結果相一致。

圖2 何首烏中不同化合物對HepaRG細胞活性的影響（,n=5）

表3 何首烏成分與MRP3對接結果

3.3 單體對MRP2、MRP3轉運體表達的影響

由結果可知（圖3），與對照組比較，大黃素-8-O-葡萄糖苷及蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷均可顯著下調HepaRG 細胞中MRP2 mRNA 表達水平（P＜0.05），上調MRP3 mRNA 表達水平（P＜0.05），且作用存在劑量效應相關性；反式二苯乙烯苷及大黃素對MRP2 mRNA 表達影響較小，但可顯著上調MRP3 mRNA表達水平（P＜0.05）。結合肝細胞毒性實驗結果，初步推測大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可通過影響MRP2、MRP3，擾動膽紅素、膽汁酸代謝循環，繼而引發肝損傷。反式二苯乙烯苷及大黃素對MRP2 的影響較小，二苯乙烯苷與MRP2 對接得分值僅為膽紅素得分值的80%，其對MRP2 的影響仍需進一步考察驗證。

圖3 何首烏中不同化合物對HepaRG細胞MRP2、MRP3 mRNA表達水平的影響（,n=5）

4 討論

截至目前，有關何首烏中肝毒性成分的研究方法涉及肝微粒體孵育法、體外細胞法、微組織芯片法、在體灌流法，以及采用大鼠、小鼠進行體內實驗等。楊敏等[26]采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法，檢測了何首烏中11 個單體成分（包括游離蒽醌、結合蒽醌及萘類）的體外肝細胞毒性，將毒性較強的單體進行大鼠肝勻漿物孵育實驗，進一步驗證其肝毒性作用。另有研究發現，何首烏及其炮制品均可抑制原代肝細胞增殖，同時可影響膽紅素及膽汁酸的正常代謝[27]。MRP2、MRP3 是膽紅素及膽汁酸重要外排轉運體，膽汁淤積的臨床特征為MRP2轉運體下調且MRP3代償性上調，加速膽酸鹽及膽紅素從肝細胞轉運至血竇[28]。因此當毒性成分作用于這2 個靶點蛋白時，存在引發肝毒性的風險。因此，本研究以MRP2、MRP3 轉運蛋白為切入點，采用計算機分子對接技術對何首烏中48 個代表性單體進行高通量篩選；選取與MRP2、MRP3對接打分值較高同時在何首烏中含量較高的單體進行體外肝細胞毒性驗證；此外，從基因層面進一步驗證待測單體是否對MRP2、MRP3 產生影響。經實驗發現，體外肝細胞毒性實驗及靶蛋白基因測定結果與分子對接實驗預測基本相一致。分子對接得分較高的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在體外細胞毒性實驗中顯示出較強的毒性作用，同時mRNA 表達水平測定結果提示兩者可對MRP2、MRP3 轉運體的表達量產生影響，存在引發膽紅素膽汁酸代謝異常產生肝毒性的可能，這與竇志華等[29]研究發現的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為大黃中主要肝毒性蒽醌類成分的結論相一致。反式二苯乙烯苷類是何首烏中一類重要組成成分，在生、制首烏中含量存在明顯差異[30]。部分學者認為二苯乙烯苷有保肝作用[31-33]。然而另有研究表明二苯乙烯苷具有一定肝臟毒性[34-35]。本研究中，反式二苯乙烯苷體外細胞實驗中表現出中等細胞毒性，而其對MRP2 mRNA 表達水平的影響作用并不顯著，這與分子對接結果存在差異，二苯乙烯苷與MRP2 對接得分值僅為陽性對照膽紅素得分值的80%，可能需調整其作用濃度，并對作用時間開展進一步實驗驗證。本研究結果可為何首烏臨床用藥的安全性評價提供參考。