HPLC-MS/MS法檢測小鼠體內京尼平苷血藥濃度的價值分析

陳小康，孫文清，王 康，張又枝,2，張玉霖,2?

（1. 湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100 ；2. 鄂南特色中藥湖北省工程研究中心，湖北 咸寧 437100）

京尼平苷是一種環烯醚萜葡萄糖苷，它是中藥梔子干燥果實中的主要活性成分。京尼平苷在其他植物中也廣泛存在，如肉蓯蓉、杜仲、牛膝、黃毛耳草等[1]。京尼平苷具有降血糖、抗抑郁、抗癌、抗炎、抑制動脈粥樣硬化等多種藥理作用[2-5]。目前報道的檢測京尼平苷血藥濃度的方法多為高效液相色譜法[6]（HPLC）和液相色譜-串聯質譜法[7]（LC-MS/MS）。本文在既有文獻的基礎上，通過優化改進建立一種能快速、準確檢測小鼠血漿中京尼平苷血藥濃度的方法，繪制京尼平苷在小鼠體內隨時間代謝的平均血藥濃度-時間曲線，得到其主要藥代動力學參數，為相關研究和臨床用藥提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀 器 液 相 色 譜- 質 譜 儀（LC-MS/MS 8040）（由日本島津公司生產），1730R 微量高速冷凍離心機（由丹麥labogene 公司生產）、AUY220 型電子天平（由日本島津公司生產）。

1.1.2 試劑 HPLC 級乙腈、甲酸（由美國Fisher公司生產），京尼平苷（HPLC ≥98% ；批號：G101668 ；由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供），芍藥苷（HPLC ≥98% ；批號：B21148 ；由上海源葉生物科技有限公司提供）。

1.1.3 實驗動物 昆明鼠27 只（體重為20 ～25 g），購于北京斯貝福生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK( 京)2016-0002。

1.2 方法

1.2.1 測定條件、溶液配制與血樣處理

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-乙酸銨（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）；流速：0.8 mL/min ；柱溫：30℃；進樣量：5 μL。

1.2.1.2 主要質譜條件 液相質譜-電噴霧離子源（ESI），離子多反應離子（MRM）檢測；接口電壓：4.5 kV；霧化氣流量：3 L/min；干燥氣流量：15.0 L/min；DL 溫度：250℃；CID 氣：230 kPa。定量離子對：京尼平苷：m/z 406.2 ～227.2（CE ：-15）；芍藥苷：m/z 498.4 ～179.15（CE ：-20）。

1.2.1.3 京尼平苷儲備液的配制 精密稱取1.5 mg的京尼平苷標準品，用44.0 μg/mL 的芍藥苷內標溶液進行超聲溶解，稀釋成含內標的105.0 μg/mL京尼平苷儲備液。

1.2.1.4 血漿樣品的處理 取100 μL 血漿樣品，加入300 μL 內標溶液（利用其溶劑乙腈沉淀蛋白），渦旋振蕩5 min，在4℃下離心（13 000 r/min）處理10 min，取上清液300 μL。在上清液中加入100 μL 的蒸餾水，渦旋混勻后經微孔濾膜過濾，按照擬定條件進行測定和分析。

1.2.2 分析方法考察

1.2.2.1 專屬性 分別取處理好的空白血漿、空白血漿+ 內標溶液、空白血漿+ 內標溶液+ 京尼平苷質控樣品、昆明鼠以150 mg/kg 的劑量灌胃京尼平苷后采集的血漿樣品，按擬定條件進行測定和分析，得到色譜圖。

1.2.2.2 標準曲線及定量下限 分別精密量取一定量的京尼平苷儲備液，用內標溶液稀釋至300 μL，制得系列標準溶液。在各溶液中加入100 μL 的空白血漿后，制成濃度分別為6037.5 ng/mL、3150.0 ng/mL、1575.0 ng/mL、787.5 ng/mL、3 7 8.0 n g/m L、1 2 6.0 n g/m L、6 3.0 n g/m L、31.5 ng/mL、15.75 ng/mL、7.35 ng/mL 的系列標準血漿樣品，并按照1.2.1.4 項“血漿樣品處理”方法自渦旋振蕩5 min，記錄峰面積。以京尼平苷與內標的峰面積比為縱坐標，以京尼平苷濃度為橫坐標，進行加權線性回歸處理（1/x2）。

1.2.2.3 精密度和準確度 配制并測定高（1575.0 ng/mL）、 中（378.0 ng/mL）、 低（63.0 ng/mL）及定量下限（7.35 ng/mL）4 個濃度的京尼平苷質控樣品，每個濃度均有5 個樣本，連續測定3 d，考察該方法的精密度和準確度。

1.2.2.4 提取回收率 取空白血漿100 μL，加入300 μL 的乙腈，渦旋振蕩5 min，在4℃下離心（13 000 r/min）處理10 min，取上清液100 μL。在上清液中加入京尼平苷儲備液和內標溶液，制得京尼平苷濃度為1575.0 ng/mL、126.0 ng/mL、15.75 ng/mL 的血漿樣品。取血漿樣品300 μL，加入蒸餾水100 μL，渦旋混勻，經微孔濾膜過濾后，按擬定條件進行測定和分析。配制相同濃度的質控血漿樣品并進樣分析。測定京尼平苷峰面積與內標峰面積的比值，分別為A 和B，提取回收率=B/A%。

1.2.3 藥物體內研究 按照給藥后取血時間的不同將27 只昆明鼠分為5 min 組、15 min 組、25 min組、35 min 組、45 min 組、55 min 組、120 min 組、240 min 組、360 min 組，每組各有小鼠3 只。將所用小鼠禁食不禁水12 h 后用150 mg/kg 的京尼平苷灌胃，各組在相應時間點經眼眶取血后，用含有肝素鈉的EP 管收集全血，在4℃的離心機中以10 000 r/min 的轉速離心20 min，按照1.2.1.4項“血漿樣品處理”方法進行處理。根據測定結果，用GraphPad Prism 9 軟件繪制平均血藥濃度- 時間曲線，用R 語言[8]按照非房室模型估算各組小鼠主要的藥代動力學參數。

2 結果

2.1 分析方法評價

2.1.1 專屬性 在擬定條件下，京尼平苷和內標（芍藥苷）的保留時間分別為4.23 min、4.98 min，化合物峰形良好，血漿內源性物質、內標（芍藥苷）和京尼平苷之間互不干擾。

2.1.2 標準曲線及定量下限 京尼平苷在7.35 ～6037.5 ng/mL 范圍內線性關系良好，回歸方 程：y=0.0124x+0.72，（r2=0.999），定 量 下 限為7.35 ng/mL（S/N ＞10）。

2.1.3 精密度和準確度 京尼平苷定量下限的日內相對標準偏差（RSD）為14.06%，日間RSD為15.85%，準確度為89.34% ；高、中、低濃度京尼平苷的日內RSD 均＜10.31%，日間RSD均＜13.03%，準確度在95.65% ～102.34% 之間。這表明，該檢測方法具有良好的精密度和準確度。

2.1.4 提 取 回 收 率 京 尼 平 苷 低、 中、 高 濃度的提取回收率分別為（85.61±1.20）%、85.06±3.93）%、（89.31±5.07）%。 這 表 明，京尼平苷的提取回收率良好且比較穩定。

2.2 藥物體內研究

用京尼平苷為昆明鼠灌胃后其平均血藥濃度- 時間曲線見圖1。其主要藥代動力學參數：t1/2=49.5 min、Cmax=3151.27 ng/mL、Tmax=25.0 min、MRT（mean residence time， 平 均 滯 留 時間）=70.76 min、AUC0-∞=208427.3 ng·mL-1·min-1、AUC0-t=256305.6 ng·mL-1·min-1。

圖1 昆明鼠體內京尼平苷平均血藥濃度-時間曲線

3 討論

本試驗發現，采用HPLC-MS/MS 法檢測小鼠體內京尼平苷的血藥濃度時，在流動相中添加0.05%甲酸時的檢測效果最佳。當流動相中乙腈占50%時，京尼平苷和內標芍藥苷的色譜峰在4.2 min 時發生重疊。通過降低乙腈所占的比例，兩個色譜峰漸漸分離。當乙腈所占的比例為30% 時，京尼平苷和芍藥苷的色譜峰具有較好的峰形且出峰時間良好，最終的色譜條件為乙腈- 乙酸銨（5 mmol/L，含0.05% 甲酸）（30:70）。本試驗在血漿樣品的處理上，借鑒了相關文獻[7,9]中的處理方法。根據本實驗室的已有條件，以氮氣吹干代替真空濃縮溶劑進行樣品濃縮時，發現樣品的處理較為繁瑣費時，且可能使誤差產生的幾率增加。通過對本試驗方法進行優化改進，使處理血漿樣品的時間大幅減少且簡化了操作步驟。在處理血漿樣品的最后，為了避免待測樣品因檢測樣本數量較大、等待時間長而導致有機相揮發，特在上清液中加入了100 μL 的蒸餾水。本研究用LC-MS/MS 測定并建立了小鼠體內京尼平苷平均血藥濃度隨時間變化的曲線，并得出了相關的藥代動力學參數，能夠為京尼平苷在小鼠體內的相關研究提供參考數據。

綜上所述，采用LC-MS/MS 并以上文中的色譜條件檢測小鼠體內京尼平苷血藥濃度的價值較高，具有操作簡單、專屬性強、穩定性和精密度高等優點。