小麥衰老相關基因TaSAG39的生物信息學及表達模式分析

孫麗麗，晉秀娟，趙 鍇，Md Ashraful Islam，盧 娟，王曙光，孫黛珍

(1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.省部共建有機旱作農業國家重點實驗室(籌)，山西 太原 030031)

小麥是世界上第一大糧食作物，目前全球小麥年產量約7億t[1-2]，占世界糧食總產量的1/3，隨著人口總量的持續增加，全世界發展中國家對小麥產量的需求還將持續增加。葉片衰老是植物生長發育的最后一個階段，過早啟動衰老進程會對植物的生長發育產生不良影響[3]。對于小麥而言，葉片衰老與籽粒灌漿同步進行，適當地延緩衰老能夠提高小麥產量、改善品質[4-7]；然而葉片衰老受基因的精細調控[8-9]。因此，挖掘衰老相關基因，解析衰老分子機制，對于提高作物的產量和改善品質具有重要的意義。

半胱氨酸蛋白酶(Senesence-specific cysteine protease,SAG39)又叫硫醇蛋白酶，是目前衰老相關基因(SAG)研究的熱點之一，不同植物在自然衰老或誘導衰老過程中的基因表達分析表明，半胱氨酸蛋白酶始終是最豐富的一類蛋白酶[10]。19世紀40年代以來，已有多種半胱氨酸蛋白酶從不同植物中被分離鑒定[11]。Beyene等[12]利用快速擴增cDNA末端(RACE)的方法，從衰老和非衰老煙葉中分離到2個cDNA，命名為NtCP1和NtCP2，通過Northern雜交檢測成熟綠色葉片和衰老葉片NtCP1和NtCP2的表達，結果表明，NtCP1主要在老化的葉片中表達，被認為是衰老特異基因，而NtCP2的表達只在成熟的綠葉中被檢測到，被認為有可能與細胞程序性死亡相關。Liu等[13]分離了水稻中衰老相關基因OsSAG39的啟動子，結果發現，隨著葉齡的增加葉片逐漸進入衰老階段，OsSAG39的表達量也逐步增加，衰老晚期時達到最大值，通過對OsSAG39的啟動子進行GUS表達分析也確定了該基因的衰老特異性。朱海生等[14]從草莓中克隆到半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，分析發現，在果實成熟及葉片衰老過程中FaCP基因表達量顯著上升，表明FaCP可能參與調控草莓果實的成熟及葉片衰老。同時研究發現，擬南芥中的SAG12[15]、玉米中的See1[16]、油菜中的BnSAG12-2[17]、煙草中的NtCP-23[18]等衰老相關基因均編碼半胱氨酸蛋白酶。目前，關于半胱氨酸蛋白酶在小麥中的研究主要集中于干旱[19-20]和抗病[21]方面，而在小麥衰老過程中發揮的作用尚不清楚。

基于山西農業大學小麥育種課題組前期對2個不同持綠類型小麥品種晉麥39(非持綠型)和太綠113(持綠型)花后不同時期旗葉進行轉錄組測序，差異表達分析發現一個被注釋為衰老特異的半胱氨酸蛋白酶的轉錄本在衰老前期該基因表達量很低，但在衰老過程中其表達量極顯著升高，且在非持綠型品種中的表達量顯著高于持綠型品種[22]，初步推測TaSAG39與小麥葉片衰老有關。

為了進一步探索TaSAG39的功能，本研究對該基因進行系統的生物信息學分析，并對不同脅迫下和葉片衰老過程中該基因的表達模式進行分析，以期為后期基因功能研究和分子育種提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種晉麥39，主要用于不同脅迫處理下TaSAG39的表達模式分析；供試小麥品種煙農19，主要用于自然衰老過程中TaSAG39的表達模式分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 挑選籽粒大小一致且飽滿的晉麥39種子，用1%的NaClO溶液浸泡15 min后，用無菌水沖洗4～5次，沖洗干凈后室溫下用自來水浸泡24 h后，移入網盒(下有托盤)中，采用1%的花無缺培養，每天更換培養液。置于人工氣候培養箱中培養：溫度22 ℃，相對濕度70%，光照強度9 000 lx，16 h光照/8 h黑暗。培養至一葉一心期(7 d左右)，對幼苗分別進行不同脅迫處理(黑暗、34 ℃高溫、16.1% PEG、50 μmol/L MeJA、50 μmol/L IAA和250 mol/L NaCl)，并分別于誘導后0，1，2，3，6，12，24，48，72 h取新鮮葉片組織，經液氮速凍后保存于-80 ℃，用于提取RNA。

用于自然衰老表達模式分析的煙農19于2019年度種植在山西農業大學農作站小麥試驗基地(北緯37°25′，東經112°25′)，分別在花后0，7，10，13，16，19，22，24，30 d取完整旗葉，經液氮速凍后保存于-80 ℃，用于提取RNA。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 利用TRIzol法提取小麥葉片總RNA，然后根據全式金生物公司的反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA后，保存于-80 ℃，用于后續熒光定量試驗。

1.2.3 生物信息學分析 將轉錄組數據中注釋為SAG39的轉錄本序列在小麥基因組URGI數據庫(https：//urgi.versailles.inra.fr/blast/)中BLAST獲得TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D等3個同源基因的cDNA和啟動子候選序列。利用NCBI-ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)工具獲取基因的開放閱讀框，并將其翻譯成氨基酸序列；將得到的氨基酸序列通過NCBI網站中的BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)功能，獲得其他物種中SAG39的氨基酸序列，用MEGA-X軟件對不同物種間SAG39構建系統進化樹，用DNAMAN軟件進行序列比對；利用在線工具Expasy-ProtParam(https：//web.expasy.org/ protparam/)進行蛋白質的基本理化性質分析；利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)分別對蛋白質二級結構和三級結構進行預測；利用SignalP 5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/index.php)和NetPhos 3.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測分析蛋白質的信號肽以及蛋白質磷酸化位點；用MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)分析蛋白質的保守基序；通過NCBI網站的Conserved Domain Database數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi)及Pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)分析蛋白質的保守結構域；用在線工具STRING(https：//string-db.org/)進行蛋白質互作網絡構建；利用在線工具PlantCARE(http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TaSAG39基因啟動子區的順式作用元件。

1.2.4 實時熒光定量PCR 用Primer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR的引物，其中，TaSAG39上游引物5′-AGGGTCTTGCGGCTGCTG-3′，下游引物5′-TCGAAGGCGTTGTCCATGAG-3′。內參基因選擇小麥Actin基因，上游引物5′-CTCCCTCACAACAACAACCGC-3′，下游引物5′-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3′。使用TaKaRa公司的熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR，每個樣品重復3次，按照公式2-ΔΔCt計算目的基因的表達量。

2 結果與分析

2.1 小麥TaSAG39蛋白的同源性分析

根據TaSAG39基因編碼的蛋白序列，利用NCBI數據庫中的BLAST搜索功能，篩選得到其他物種中SAG39的氨基酸序列。運用MEGA-X軟件的最大似然法構建系統發育進化樹，結果表明(圖1)，小麥TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D與其他單子葉植物節節麥、野生二粒小麥、硬粒小麥、大麥、二穗短柄草、菰、水稻中的SAG39聚為一類，畫眉草、南荻、高粱、玉米、馬唐、谷子、柳枝稷、稷中的SAG39聚為一類。同時發現，TaSAG39-5A、TaSAG39-5B、TaSAG39-5D基因所編碼的氨基酸在進化上與節節麥、野生二粒小麥、硬粒小麥聚為一類，說明其親緣關系最近，表明該蛋白氨基酸序列在小麥的進化過程中具有較高的保守性。除此之外，其與大麥中的SAG39親緣關系最近。進一步對TaSAG39蛋白進行多重比對同樣發現(圖2)，不同物種中的SAG39氨基酸序列具有典型EFNIN結構和催化三聯體(Cys-His-Asn)，這些結構是木瓜蛋白酶家族基因的典型特征[23]。同時比對發現，不同物種SAG39氨基酸序列中均含有相同的2個保守結構域組織蛋白酶前體抑制結構域I29(Inhibitor_I29)和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1結構域(Peptidase_C1)。

圖1 TaSAG39蛋白系統進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of TaSAG39 protein

*.二硫鍵位點；黃色方框.EFNTIN結構；藍色方框.半胱氨酸蛋白酶活性(Cys-His-Asn)；紅色線條.保守結構域Inhibitor_I29和Peptidase_C1。*.The disulfide bond site；The yellow box.The structure of EFNIN；The blue box.The cysteine protease activity(Cys-His-Asn)；The red line.The conserved domain Inhibitor_I29 and Peptidase_C1.

2.2 小麥TaSAG39蛋白理化性質

預測TaSAG39蛋白質理化性質，結果顯示，TaSAG39蛋白編碼345～349個氨基酸，在3個同源蛋白中含量最高的氨基酸均為丙氨酸，TaSAG39-5A為15.3%、TaSAG39-5B為15.5%、TaSAG39-5D為15.4%，在TaSAG39-5A、TaSAG39-5D中含量最低的為谷氨酰胺，TaSAG39-5B中含量最低的為組氨酸，均為1.4%(圖3)。3個同源蛋白的分子質量約為37 ku，理論等電點為5.53～5.67，為酸性蛋白；帶正電殘基(Arg+Lys)為35～36，帶負電殘基(Asp+Glu)為40～42，表明該蛋白在中性條件下帶負電；蛋白質的不穩定系數為34.59～38.07，屬于穩定蛋白；脂肪指數約為71，親水性約為-0.174，表明該蛋白為親水性蛋白(表1)。可以看出，這3個同源蛋白質的理化性質差異不大。

圖3 TaSAG39氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of TaSAG39

表1 TaSAG39蛋白質理化性質Tab.1 Physicochemical properties of TaSAG39 protein

2.3 小麥TaSAG39蛋白二級結構、三級結構預測

預測小麥TaSAG39s蛋白的二級結構，如圖4所示，TaSAG39s蛋白的二級結構均含有α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈，且占比最大的均為無規則卷曲，為40.97%～42.61%；其次為α-螺旋，介于35.26%～38.68%；延伸鏈所占比例介于13.91%～16.47%；占比最少的為β-轉角，為6.02%～6.96%。由此可見，小麥TaSAG39蛋白的主要構成元件為無規則卷曲，構成酶活性部位或蛋白質特異的功能部位，而α-螺旋為次要構成元件來連接其他二級結構。

圖4 TaSAG39蛋白質二級結構預測Fig.4 Prediction of secondary structure of TaSAG39 protein

對TaSAG39s蛋白質的三級結構進行預測，結果顯示(圖5)，3個同源蛋白的同源建模的參考模板均為SMTL中的6u7d.1.A，GMQE約為0.72，QMEAN4約為0.75，表明該結果可用。結果顯示，該蛋白的三級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋構成，與二級結構預測結果一致。且發現TaSAG39-5A與TaSAG39-5D的三級結構基本一致，而TaSAG39-5B的三級結構略有不同，但是基本一致。

圖5 TaSAG39蛋白質三級結構預測Fig.5 Prediction of tertiary structure of TaSAG39 protein

2.4 小麥TaSAG39蛋白的信號肽以及磷酸化位點預測

TaSAG39的3個同源蛋白質的信號肽預測結果一致，分析結果顯示(圖6)，其蛋白質N端含有一段18個氨基酸殘基的信號肽序列，序列為MSRSTLIILALLAVSSAVA，推測TaSAG39基因編碼的蛋白可能為分泌蛋白。

圖6 TaSAG39蛋白信號肽預測Fig.6 Prediction of signal peptide of TaSAG39 protein

磷酸化位點分析結果顯示(圖7)，TaSAG39s蛋白有35～37個磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點最多，約18個，蘇氨酸磷酸化位點占比第2(約13個)，酪氨酸磷酸化位點最少，約6個；且其中有4個絲氨酸磷酸化位點的值均高于0.980，約達標準值的2倍。因此，推測該基因通過絲氨酸磷酸化修飾調控為主、蘇氨酸磷酸化修飾調控為輔來實現其功能。

圖7 TaSAG39蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Prediction of phosphorylation site of TaSAG39 protein

2.5 小麥TaSAG39蛋白的保守基序及其保守結構域分析

為了更好地了解TaSAG39基因的功能，對小麥TaSAG39蛋白的保守基序、結構域以及基因結構進行分析，結果發現(圖8)，在小麥TaSAG39蛋白中含有10種保守基序，且除TaSAG39-5B中缺失一個Motif 10外，在3個同源蛋白中這些保守基序基本一致，在Pfam上預測發現在Motif 1、Motif 3、Motif 4中均存在Peptidase_C1結構域，Motif 2中存在Inhibitor_I29結構域。同時將3個基因組的蛋白序列在NCBI中的Conserved Domain Database進行保守結構域預測，結果表明(圖9)，TaSAG39的3個基因組均包含2個保守結構域組織蛋白酶前體抑制結構域I29(Inhibitor_I29)和木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶Pept_C1結構域(Peptidase_C1)，預測結果與保守基序預測結果相對應。分析TaSAG39的基因結構發現(圖10)，該基因位于第5號染色體上，3個基因組均包含2個外顯子和1個內含子，其中TaSAG39-5A全長1 455 bp，編碼區1 041 bp；TaSAG39-5B全長1 435 bp，編碼區1 050 bp；TaSAG39-5D全長1 439 bp，編碼區1 038 bp。

圖8 TaSAG39蛋白的保守基序分析Fig.8 Conserved motif analysis of TaSAG39 protein

圖9 TaSAG39蛋白的保守結構域Fig.9 Conserved domains of TaSAG39 protein

圖10 TaSAG39的基因結構分析Fig.10 Analysis of TaSAG39 gene′s structure

2.6 小麥TaSAG39蛋白的互作網絡分析

通過在線工具STRING構建TaSAG39蛋白互作網絡關系，結果發現，TaSAG39蛋白與2個半胱氨酸蛋白酶抑制劑(TraesCS3D02G325100、TraesCS5A02G487700)、2個半胱氨酸蛋白酶RD19D(TraesCS2A02G187400、TraesCS2B02G219900)、4個糖苷水解酶(TraesCS3B02G045700、TraesCS4B02G021800、TraesCS4D02G019500、TraesCS2A02G122200)、1個14-3-3蛋白(TraesCS4B02G148900)和1個未注釋的蛋白(TraesCS2B02G234400)互作，其中TaSAG39與半胱氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶RD19D有多種證據表明存在相互作用關系(圖11)。

圖11 TaSAG39蛋白互作分析Fig.11 The analysis of TaSAG39 protein interaction networks

2.7 小麥TaSAG39基因的順式作用元件分析

利用PlantCARE對TaSAG39的3個基因組起始密碼子上游2 000 bp的序列進行順式作用元件分析，結果表明(圖12)，TaSAG39的3個基因組啟動子均存在著大量的順式作用元件，如響應脫落酸的順式作用元件ABRE，光脅迫響應元件G-box、GT1-motif、Sp1，茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif，干旱響應元件MYC、DRE core，生長素響應元件TGA-element，高溫響應元件STRE，低溫響應元件LTR、厭氧誘導響應元件ARE，其中光響應元件和干旱響應元件最多，茉莉酸甲酯、脫落酸以及溫度響應元件相對較多；此外發現，TaSAG39-5A、TaSAG39-5D基因組啟動子區還含有與分生組織表達相關的順式作用元件CAT-box，表明TaSAG39可能參與小麥生長發育的調節及非生物脅迫響應。

圖12 TaSAG39啟動子區順式作用元件Fig.12 Cis-acting elements in the promoter region of TaSAG39

2.8 小麥TaSAG39的表達特性分析

為了進一步明確小麥TaSAG39基因的潛在功能，根據該基因啟動子上的順式作用元件，通過qRT-PCR分析其在自然衰老及非生物脅迫下的表達情況，從圖13可以看出，在自然衰老及6種非生物脅迫下，TaSAG39的表達量均發生了明顯變化。在自然衰老過程中，花后前期TaSAG39的表達量沒有明顯的變化，在花后30 d其表達量急劇增高，達到花后0 d的360倍；在黑暗處理中，隨著處理時間的延長，TaSAG39的表達呈現先下降后上升再下降的趨勢，且在處理6 h基因的表達量達到最高，為處理前的4.5倍；在PEG模擬的干旱處理下，脅迫2 hTaSAG39的表達量達到對照的14倍，在隨后的脅迫時間內表達量呈現下降趨勢；在生長素(IAA)處理下，除脅迫2 hTaSAG39的表達量低于對照外，其余時間段均高于對照且呈現出先上升后下降的趨勢，12 h達到最大值；在茉莉酸甲酯(MeJA)和高溫脅迫下，TaSAG39的表達量均呈上升—下降—上升—下降—上升的趨勢，分別在24，12 h表達量達到最大值，分別為對照的3.9,2.1倍；在NaCl處理下，除72 h外，TaSAG39整體表現出表達量下降趨勢，且在處理2 h降低至臨界值，為處理前的0.003倍左右。

不同小寫字母表示不同樣本之間TaSAG39表達量的顯著性差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference in the expression of TaSAG39 gene in different samples at 0.05 level.

3 結論與討論

半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，廣泛參與植物的各種生理過程，如種子萌發、低溫、干旱、鹽等環境脅迫以及衰老等[24-25]。因此，研究半胱氨酸蛋白酶對于研究植物抗逆和植物生長發育過程具有重要作用。

本研究對小麥中半胱氨酸蛋白酶基因TaSAG39進行分析，結果發現，TaSAG39蛋白為穩定的帶負電的親水性蛋白，且該蛋白主要由無規則卷曲和α-螺旋構成，與前人報道相一致[26]。此外，氨基酸序列中含有木瓜蛋白酶亞家族共有的活性位點Cys-His-Asn以及EFNIN結構域，其中氨基酸序列N端有18個氨基酸殘基編碼的信號肽以及一個肽酶抑制劑結構域，C端有木瓜蛋白酶亞家族的保守結構域，與前人報道木瓜蛋白酶的氨基酸序列從N端到C端劃分為信號肽序列、前體肽序列和成熟酶序列3個區域一致[27]。

啟動子是基因表達調控的重要元件，而順式作用元件作為啟動子中與轉錄因子結合的一段特異序列，其在啟動子中的類型、數目以及它們之間的順序和距離都會影響到基因的表達效率及強弱[28]，因此，分析基因啟動子所含順式作用元件可為研究基因的結構、表達模式和功能提供一定的參考。本研究對TaSAG39啟動子上的順式作用元件進行分析發現，該基因的啟動子上包含大量的非生物脅迫和激素響應的順式作用元件，如干旱、光、熱、茉莉酸甲酯、生長素以及脫落酸等。前人研究表明，在植物中半胱氨酸蛋白酶基因啟動子區中常常含有許多脅迫響應元件，如脫水響應元件、脫落酸響應元件等[23]。本研究發現，TaSAG39在自然衰老、黑暗、干旱、高溫、鹽脅迫和茉莉酸甲酯以及生長素處理下可以被不同程度地誘導表達，其中在自然衰老、黑暗、干旱、高溫脅迫以及茉莉酸甲酯、生長素激素處理下上調表達，與小麥中其他編碼半胱氨酸蛋白酶的基因TaCP1[19]、TaCP3[20]表達模式相似；在鹽脅迫下表達受到抑制，與柑橘中CsCysP研究結果相反[29]。推測其原因可能是因為不同基因啟動子中所含有順式作用元件的種類和個數不同，因此其響應脅迫時基因的表達模式也不同。

本研究通過蛋白互作分析發現，TaSAG39可能與半胱氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶RD19D、糖苷水解酶以及14-3-3蛋白之間發生互作。半胱氨酸蛋白酶抑制劑可通過與半胱氨酸蛋白酶的活性位點直接相互作用來抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，進一步阻止蛋白質的水解，參與環境脅迫應答、細胞程序性死亡以及新陳代謝的調節[30]，推測TaSAG39可能與半胱氨酸蛋白酶抑制劑相互作用來共同調節小麥葉片衰老及脅迫響應。Kunert等[31]研究也表明，在菠菜的衰老葉片中半胱氨酸蛋白酶抑制劑可與半胱氨酸蛋白酶相互作用來參與菠菜衰老過程。14-3-3蛋白是一個特殊的磷酸化結合蛋白，能夠與含有絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點的蛋白質相互作用，在植物激素信號轉導及碳代謝中發揮著重要作用[32-33]。對TaSAG39s編碼的蛋白質進行磷酸化分析發現，其包含大量的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點，推測14-3-3蛋白可能與TaSAG39蛋白結合進而參與植物激素信號轉導及碳代謝，其還有待于進一步深入研究。