外施2，4-表油菜素內酯緩解冬小麥拔節期凍害脅迫效應

張奧深，雍曉宇，韓巧霞，姚永偉，師煥婷，李鴿子，康國章

(河南農業大學 農學院，國家小麥工程技術研究中心，河南 鄭州 450046)

小麥作為我國三大糧食作物之一，其產業發展直接影響到國家糧食安全和社會穩定。近年來，隨著全球氣候變暖，極端低溫災害頻繁發生，嚴重影響了小麥的穩產、高產[1]，其中倒春寒是黃淮麥區最嚴重的災害，在我國冬麥主產區黃淮麥區，小麥凍害發生的頻率越來越高，對小麥造成的危害也越來越嚴重[2]。小麥拔節期到抽穗前是小麥生長速度最快，生長量最大的時期，葉面積及莖穗的長度和體積成倍或幾十倍增長，干物質積累也進入迅速增長階段，此時小麥生長旺盛，抗寒能力弱[3]，低溫對小麥造成的不利影響較為嚴重[4]。

油菜素內酯(Brassinolide，BR)又稱蕓薹素內酯[5]，是廣泛存在于植物體內、參與各種生理活動的一種天然化合物，被稱為第六種植物激素[6]。BR是公認的高效、廣譜、無毒的一種植物生長調節劑。2，4-表油菜素內酯(2，4-Epibrassinolide，EBR)是一種人工合成的高活性油菜素內酯類似物，外施EBR能夠提高作物的抗逆能力[7]。尚宏芹等[8]研究表明，葉面噴施EBR可通過提高小麥幼苗的抗氧化酶活性和抗氧化物質含量、降低MDA和H2O2含量，減輕重金屬汞對幼苗的傷害，促進小麥幼苗的生長。孫玉珺等[9]研究表明，外源BR處理可提高幼苗生物量、抗氧化酶活性以及Pro、可溶性糖和可溶性蛋白含量，降低MDA含量，緩解低溫脅迫對玉米生長的抑制程度。劉麗杰等[10]研究發現，利用0.1 mg/L的EBR處理小麥幼苗，可提高小麥的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性，可溶性糖和Pro含量顯著提高，降低MDA含量，從而提高小麥的抗凍性。前人從生理層面對EBR提高作物的耐受性進行研究，證實EBR對多種逆境脅迫具有緩解作用，但從基因層面對EBR的作用機制研究較少。

本試驗以半冬性品種百農207為材料，在小麥拔節期外源澆施EBR，并利用人工氣候室模擬低溫凍害，研究凍害脅迫條件下小麥植株生理指標、抗逆相關基因表達量、幼穗受凍率、籽粒產量、千粒質量以及地上部干物質質量的變化，探究外源EBR緩解小麥低溫凍害的生理機制，以期為減輕倒春寒對小麥的危害提供理論依據和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設計

供試材料為普通半冬性小麥品種百農207。試驗采用盆栽，2020年秋季種植在河南省鄭州市毛莊河南農業大學科技園試驗田中，盆的直徑為30 cm，高為30 cm，三葉期每盆定苗16株。盆栽用土為0～30 cm的耕層土壤，每盆裝過篩壤土8 kg，并均勻施入尿素2.3 g、磷肥0.8 g和鉀肥3.4 g，之后埋于試驗田中，盆的頂部邊緣與地面齊平。

在前期試驗篩選EBR濃度的基礎上，待小麥生長至拔節期時澆施濃度為0.1 mg/L的EBR 400 mL，對照(CK)施用同等體積的水。小麥植株充分吸收24 h后，將盆栽移入人工氣候室內-5 ℃低溫連續處理48 h，在處理0，24，48 h分別剪取主莖最上部全展葉，用于生理指標的測定及基因表達分析，每個處理重復3次。

1.2 生理指標測定

在凍害脅迫處理前后利用SPAD-502葉綠素儀測定小麥最上部全展葉的SPAD值，每盆測5片葉片取平均值。利用硫代巴比妥酸(TCA-TBA)顯色法測定葉片MDA含量，采用酸性茚三酮法測定Pro含量，利用電導率儀測定葉片相對電導率[11]。

1.3 基因表達分析

取小麥葉片0.1 g，利用總RNA提取試劑盒(Vazyme，南京)提取總RNA，反轉錄試劑盒(Vazyme，南京)合成cDNA第一鏈。在前期研究中，小麥高產抗逆分子調控創新團隊篩選出與凍害脅迫相關的5個抗逆基因：SOD[12]、POD[13]、CAT[14]、P5CS[15]和WCS120[16]。本研究以小麥Actin作為內參基因，對5個抗逆相關基因進行轉錄水平的檢測。采用軟件Primer Premier 5.0設計引物(表1)，由河南尚亞生物技術有限公司進行合成。2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物信息Tab.1 qRT-PCR primer information

1.4 小麥幼穗受凍率調查和籽粒產量、千粒質量、干物質質量測定

在拔節期對盆栽小麥外源施用EBR 24 h后，進行凍害脅迫處理(48 h)，自然條件下恢復生長，15 d后調查幼穗受凍后死亡情況，取其平均值計算幼穗受凍率；于成熟期按盆收獲籽粒計算籽粒產量；按處理隨機選取1 000個籽粒確定千粒質量；將收獲后小麥植株地上部放入烘箱，105 ℃殺青30 min后80 ℃烘干，計算干物質質量。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理，采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，采用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后植株葉片SPAD值的變化

如圖1所示，凍害脅迫前，外施EBR處理組與對照的SPAD值無顯著差異，在凍害脅迫后，葉片的SPAD值隨凍害脅迫時間的延長呈下降趨勢，在同一脅迫時間處理組的SPAD值始終顯著高于對照，這表明小麥拔節期外施EBR可以緩解凍害脅迫下葉片衰老，延長葉片的功能期。

柱上不同小寫字母均表示在5%水平差異顯著。圖2—5同。The different lowercase letters on the columns indicate significant differences at the 5% level.The same as Fig.2—5.

2.2 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后植株葉片MDA含量和相對電導率的變化

凍害脅迫處理前外施EBR的小麥植株和對照植株葉片MDA含量差異不顯著；凍害脅迫24 h對照組MDA含量顯著升高，而外施EBR處理組小麥植株葉片MDA含量與凍害脅迫前無顯著變化；而凍害脅迫處理時間達到48 h，二者的MDA含量均較處理24 h顯著下降，且處理組MDA含量顯著低于對照組。結果表明，拔節期外施EBR可以降低小麥植株葉片MDA含量，從而減輕其膜脂過氧化程度(圖2)。

圖2 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后葉片的MDA含量Fig.2 MDA content in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

在凍害脅迫處理前外施EBR植株葉片的相對電導率與對照無顯著差異，在低溫脅迫24，48 h，外施EBR的植株相對電導率均顯著低于對照(P<0.05)，分別降低了8.19，7.03百分點(圖3)。

圖3 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后葉片的相對電導率Fig.3 Relative conductivities in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.3 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后植株葉片Pro含量的變化

由圖4可知，對照組在凍害脅迫下，Pro含量呈現逐漸下降趨勢；而外施EBR的處理組在脅迫條件下，葉片的Pro含量逐漸上升；在凍害脅迫48 h，處理組小麥葉片的Pro含量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖4 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后葉片Pro含量Fig.4 Proline contents in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.4 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后植株葉片抗逆相關基因表達量變化

在凍害脅迫處理前，除P5CS其余4個抗逆相關基因的表達量處理組均顯著高于對照組(P<0.05)；處理組小麥植株在凍害脅迫24 h，葉片中的SOD、POD和CAT的表達量較脅迫處理前均顯著降低，而P5CS和WCS120的表達量均顯著上升；對照組在凍害脅迫處理24 h，SOD、CAT的表達量較凍害脅迫處理前無顯著變化，P5CS和WCS120的表達量均顯著上升。凍害脅迫處理48 h與24 h相比，處理組的SOD、POD、CAT和WCS120的相對表達量均顯著提高；而對照組的SOD、P5CS和WCS120表達量無顯著變化。在凍害脅迫處理48 h，處理組的5個抗逆相關基因表達量均顯著高于對照(P<0.05)(圖5)。

圖5 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后葉片抗逆相關基因的相對表達量Fig.5 Relative expression leaves of stress resistance related genes in wheat leaves under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

2.5 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后植株幼穗受凍率、籽粒產量、千粒質量和干物質質量的變化

外施EBR的處理組小麥植株幼穗受凍率比對照組降低了20.93百分點；處理組的植株籽粒產量和干物質質量每盆分別較對照增加了19.38，54.40 g，處理組千粒質量較對照增加了2.37 g，均顯著高于對照。說明在拔節期外施EBR能夠提高小麥幼穗的抗凍性和干物質積累量，從而提高小麥產量(表2)。

表2 小麥拔節期外施EBR凍害脅迫后幼穗受凍率、籽粒產量、千粒質量和干物質質量Tab.2 The damage rates of young ears，grain yields，1 000 grains weights and dry matter qualities in wheat under freezing stress after external application of EBR at jointing stage

3 結論與討論

油菜素內酯是一種多羥基甾類化合物，是調節植物逆境脅迫傷害的重要生長調節劑，參與不同植物的生長、發育和抵抗外界脅迫等生物學功能[17-18]。外源EBR對植物逆境脅迫緩解方面的生理作用日益受到關注[19-21]。華智銳等[22]研究發現，在干旱脅迫下，經BR處理的小麥幼苗抗氧化酶活性提高，MDA含量降低，相對含水量提高，從而提高了小麥幼苗的抗旱性。李淑葉[23]在低溫處理前對棉花葉面分別噴施不同濃度的EBR和蒸餾水，結果表明，外源噴施適宜濃度的EBR較噴施蒸餾水可顯著提高葉片Pro含量、凈光合速率、植株的干鮮質量，降低MDA含量和相對電導率。唐秀巧等[24]在小麥灌漿期高溫前通過葉面噴施磷酸二氫鉀(PDP)和BR均能顯著延緩灌漿期葉片衰老，促進干物質積累。植物在逆境脅迫下會產生活性氧，破壞細胞膜結構，阻礙葉綠素合成，降低SPAD值，從而破壞光系統，減少植物干物質積累量[25]。本試驗研究結果表明，在連續凍害脅迫48 h，外施EBR的處理組小麥MDA含量和相對電導率顯著降低，而Pro含量顯著提高，SPAD值、籽粒產量、千粒質量和地上部干物質質量均顯著高于對照，與前人研究結果一致。

在植物逆境研究中，前人的研究表明，抗氧化酶SOD、POD、CAT 等活性的高低與植物的抗逆能力密切相關[26]，但植物體內其他的水解酶的存在，極易影響抗氧化酶的提取與活性的測定，而進行轉錄水平的檢測則受其他水解酶的影響較小。在前期研究中，本課題組篩選出與凍害脅迫相關的5個抗逆基因SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120。其中，SOD基因控制超氧化物歧化酶的合成，超氧化物歧化酶作為清除植物體內活性氧(ROS)的清除劑，是首個響應逆境脅迫并參與反應的酶[12]；POD基因控制過氧化物酶的合成，過氧化物酶能分解植物體內的H2O2，降低其對細胞的危害[13]；CAT基因控制過氧化氫酶的合成，過氧化氫酶是一種強抗氧化酶，催化H2O2分解成水和氧，在植物對非生物脅迫的響應中起著關鍵作用[14]；WCS120基因是一種受低溫特異性誘導的基因，其編碼的蛋白質被認為在小麥的冷馴化過程中起著重要的作用，WCS120蛋白的積累量與高抗凍冬小麥組織的耐寒性呈正相關[16]。吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)是脯氨酸合成中谷氨酸合成途徑的關鍵酶[15]，Pro含量和植物的逆境耐受力呈正相關[27]，植物體內的Pro含量與P5CS基因的相對表達量呈正相關[28-29]。因此，SOD、POD、CAT、P5CS和WCS120這5個抗逆相關基因的相對表達量可作為小麥抗凍性的參考依據。本試驗研究結果表明，在凍害脅迫處理48 h，對照組SOD基因的相對表達量較凍害脅迫處理前無顯著變化，POD、P5CS和WCS120均顯著升高，而外施EBR的處理組小麥植株，除SOD外POD、CAT、P5CS和WCS120的表達量較凍害脅迫處理前均顯著提高，在凍害脅迫48 h 5個抗逆基因的相對表達量均顯著高于對照。

在凍害脅迫條件下，抗逆基因轉錄水平的檢測結果與生理指標鑒定結果一致，表明在凍害脅迫下，外施EBR可提高小麥植株的抗氧化酶活性，增加其清除活性氧的能力，降低膜脂過氧化程度；同時P5CS基因的高表達表明，外施EBR可提高植株體內游離脯氨酸含量，增加小麥的抗寒性。SPAD值的顯著提高表明，外施EBR可緩解凍害脅迫下小麥葉片衰老，延長其功能期，提高小麥植株物質積累量；幼穗受凍率的檢測結果同樣表明，在小麥拔節期外施EBR可降低其幼穗受凍率，提高籽粒產量和千粒質量。因此，EBR拔節期外施可起到緩解凍害的效應，從而提高小麥的抗凍性。基于此，在春季低溫凍害來臨之際，可以通過施用EBR減輕低溫凍害對冬小麥生產造成的產量損失。