金刺梨果渣發酵蛋白飼料研究

孔令磊 汪凱莎 唐婷婷

(安順學院農學院，貴州 安順561000)

金刺梨(RosaSterilisS.D.shi)還被稱為“無籽刺梨”，1981年全省刺梨資源調查時首次發現，時圣德先生1985年發表于貴州省植物園[1]。金刺梨具有少刺無籽、酸甜可口、口感較脆的特點。金刺梨果實中含多種氨基酸、礦物質營養元素和維生素，并且營養元素含量非常豐富。其中VC 和黃酮的含量比一般的水果都要高，因此還被譽為“VC之王”。VC的含量中高達14.83mg/g[2]。 如今，金刺梨栽培技術日益成熟[3-7]，在貴州安順得到大面積種植及推廣，對金刺梨研究也越來越多，多家研究機構，單位和個人對金刺梨的營養成分進行分析[8-10]，果實除鮮食外，還可加工成金刺梨酒、金刺梨飲料、金刺梨酥、食醋和果醬等[11-12]，金刺梨中所含單寧[13]在多種醫療保健中得到應用，由于金刺梨很高的利用和營養價值，被人們稱為“新山珍”[14]。

發酵飼料，是利用各類糟渣、食品加工后留下的副產物、雜粕等原料通過微生物的分解和轉化等，產生更利于畜禽采食和利用的飼料。通過發酵后提高其飼用價值，并在一定程度上豐富氨基酸、蛋白質等營養物質[15]。近幾年來，發酵飼料作為一種新型無抗飼料得到廣泛的研究和發展[16]。其優勢原料簡單易得，來源廣泛，經過發酵后的飼料具有獨特的香味，不僅能提高動物的采食率以及消化利用率，還能增強動物機體免疫力[17]。

本研究使用金刺梨果渣(由天賜貴寶公司提供)，經過烘干處理，并使用選定的菌種培養獲取生長曲線后種對其進行發酵。測量金刺梨果渣在發酵前后的營養成分差異，以蛋白質為參照研究金刺梨果渣在發酵后是否可作為一種理想的蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金刺梨果渣(由天賜貴寶公司提供)、產朊假絲酵母(Candida utilis、網上購買)、酵母膏(生物試劑)、蛋白胨(生物試劑)、瓊脂粉(生物試劑)、葡萄糖(分析純)、無水乙醇(分析純)。

1.2 儀器與設備

折光儀、紫外可見光光度計(UV-5200PC、上海元析儀器有限公司)、高壓滅菌鍋(LDZX-50KB、上海申安醫療器械廠)、超凈工作臺(CJ-2D、天津泰斯特儀器有限公司)、恒溫培養箱(DHP-9050B、上海瑯軒實驗設備有限公司)、振蕩培養箱(HZQ-F100、江蘇省太倉市華美生化儀器廠制造)、燒杯、玻璃棒、玻璃漏斗、培養皿、量筒、酒精燈、移液槍、接種環。

1.3 實驗方法

金刺梨果渣發酵工藝路線：金刺梨果渣→發酵前營養成分的測定(氨基酸、蛋白質、總糖、維生素C)→發酵菌種的選取、分離、純化、鑒定→獲取發酵菌種的生長曲線→金刺梨果渣固態發酵(不同的無機氮源、菌種接種量、料液比進行單因素實驗)→干燥→粉碎→發酵后營養成分的測定→果渣發酵前后營養成分的對比分析。

1.3.1 金刺梨果渣蛋白質含量的測定

蛋白質的測定通過考馬斯亮藍G-250法[18]，繪制標準曲線見圖1:

圖1 蛋白質標準曲線

通過標準曲線查找到金刺梨果渣樣品中的蛋白質的含量(平均值)，通過公式(1)計算出樣品中總氨基酸的含量：

公式(1)：蛋白質的含量(mg/g)=(M×V×100) / (m×v×1000)

式中：V:樣品提取液的總體積 mL；M：標準曲線上查找所得的蛋白質含量ug ；m：所稱取樣品的重量g；v：測定時量取的樣品體積 mL。

1.3.2 金刺梨果渣總氨基酸含量的測定

氨基酸的測定使用茚三酮顯色法[19]，繪制標準曲線見圖2:

圖2 氨基酸標準曲線

在標準曲線上查找出氨基酸的含量(平均值),通過公式(2)計算出樣品中總氨基酸的含量:

公式(2)：樣品中氨基酸的含量(mg/100g)=(M×V×100)/(v×m×1000)

式中：M：標準曲線上查找所得的氨基酸含量ug；V：金刺梨果渣提取液的總體積 mL； v：測定時量取的金刺梨果渣液的體積 mL； m:實際所用金刺梨果渣的重量g。

1.3.3 金刺梨果渣總糖含量的測定

利用折光儀，將果渣碾碎有果汁流出，取適量果汁于折光儀棱鏡玻璃面上進行觀測，明顯分界線刻度，即為金刺梨果渣的總糖的濃度。

1.3.4 金刺梨果渣維生素C含量的測定

果渣維生素C含量的測定使用2，6-二氯酚靛酚滴定法[20]，通過公式(2)計算出樣品中維生素C的含量：

公式(3)：維生素C的含量(mg/100g)=[(V-V1)×V2×K](V3×M)

式中：V：樣品滴定時消耗滴定液的體積 mL，VM1：空白對照消耗值 mL，V2：樣品提取液體積 mL，K：染料標定值 mL，V3：測量的樣品液 mL，M：果渣質量g。

滴定過程中空白對照的平均值1.9 mL。染料標定的平均值9.6 mL。

1.3.5 菌種的活化培養

菌種選取經過產朊假絲酵母(Candida utilis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces Fragilis)、啤酒酵母(Sac-charomyces cerevisiae)、白地霉(Geotrihum candidum Link)四種菌種進行對比，選取合適的菌種來進行刺梨果渣的發酵。

經各項指標對比后選用產朊假絲酵母：產朊假絲酵母蛋白質的含量占菌體干物質的2/3，產朊假絲酵母細胞中維生素B和RNA以及礦物質[21]含量極其豐富,而且產朊假絲酵母中酶的含量很多，這些酶類在發酵中至關重要的作用，這些酶類能將淀粉和纖維素進行水解，是將發酵物轉化為易被畜禽動物體消化吸收的低分子物質的重要媒介。產朊假絲酵母的細胞壁的含量是菌體重量的五分之一，其中有22%的物質是糖蛋白、外壁的甘露寡糖、內壁的β-葡聚糖具有激發或增強畜禽動物機體免疫功能的重要物質，其中β-葡聚糖含量高達二分之一以上[22-24]。

產朊假絲酵母是生產食用、藥用或飼料用單細胞蛋白的優良菌種。其中甘露糖和β-葡聚糖可以為禽類動物增強機體免疫力，是蛋白飼料優質的發酵菌種。還含有豐富的酶類，這些酶類在發酵中能將淀粉和纖維素進行水解，將發酵物轉化為易被畜禽動物體消化吸收的低分子物質。

將選取好的菌種經過分離、純化后進行鑒定。純化后的酵母取出觀察，其形態乳白色，平滑，有光澤，邊緣整齊或菌絲狀見圖3圖4:

圖3 純化后的酵母 圖4 純化后的酵母

純化后的酵母接種到250ml裝有100ml液體培養基中設置溫度29℃，轉速160r/min培養24h后關閉轉速繼續培養8h。觀察液體上層不產醭見圖5，錐形瓶底有菌體沉淀見圖6。

圖5 液體培養后的酵母 圖6 液體培養后的酵母

1.3.6 菌種的生長曲線

將分離純化好的酵母取出接種，將其接種到裝有100mlYPD液體培養基的錐形瓶中用橡膠塞封住瓶口后放入振蕩培養箱中進行振蕩培養，把溫度調為29℃，轉速設置為160r/min進行振蕩培養，12h后取出備用。

用滅菌移液槍準確吸取培養到生長對數期的菌液10.0ml，取提前配置好的YPD液體培養基90毫升，放入250ml錐形瓶中，再將菌液放入其中，封口。放入振蕩培養箱中，打開培養箱，把溫度調為29℃，轉速設置為160r/min進行振蕩培養。

進行時間段取樣，取樣時間分別0、4、8、12、16、20、24、28、32、34、36、40、44h按無菌操作進行取樣，將取得的菌液在波長600nm下測量吸光度。然后繪制生長曲線，該曲線是以菌液吸光度值×稀釋的倍數為縱坐標，培養時間為橫坐標。測量后得出產朊假絲酵母培養液吸光度值和生長曲線，吸光度值表見表1。

表1 產朊假絲酵母不同時間培養液吸光度A

生長曲線見圖7：

圖7 產朊假絲酵母生長曲線

由圖7可知，產朊假絲酵母生長對數期在4～28h，平穩期在28～32h，且在28h時生長對數期達最大吸光值6.470。32h后產朊假絲酵母生長開始衰退。

1.3.7 尿素對發酵結果的影響

在金刺梨果渣發酵預實驗過程中，金刺梨的含氮量較少，無法滿足微生物生長需求，也不能利用無機氮源合成蛋白質。因此在發酵過程重要加入少量的尿素[16]。

實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，添加不同尿素1.5%、2%、2.5%，以接種量10%、料液比1∶1制成固體培養基進行單因素實驗，在自然pH環境下，29.5℃恒溫培養箱中發酵4d。發酵后在烘箱中60℃烘干，測定發酵后的蛋白質。其發酵因素及其發酵后蛋白質和氨基酸的含量如圖8所示。

圖8 不同尿素對發酵結果的影響

由圖8可知，當尿素的添加量為2%時，蛋白質和氨基酸的含量最高。

1.3.8 不同接種量對發酵結果的影響 實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以不同接種量10%、12%、15%、17%、20%料液比1：1制成固體培養基進行單因素實驗，在自然pH環境下，29.5℃恒溫培養箱中發酵4d。發酵后在烘箱中60℃烘干，測定發酵后的蛋白質。其發酵因素及其發酵后蛋白質和氨基酸的含量見圖9。

圖9 不同接種量對發酵結果的影響

由圖9可知，當接種量為15%時，蛋白質和氨基酸的含量最高。

1.3.9 不同料液比對發酵結果的影響

實驗稱取烘干后的金刺梨果渣果渣10g，尿素2%，以接種量10%，以不同料液比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5制成固體培養基進行單因素實驗，在自然pH環境下，29.5℃恒溫培養箱中發酵4d。發酵后在烘箱中60℃烘干，測定發酵后的蛋白質。其發酵因素及其發酵后蛋白質和氨基酸的含量見圖10。

由圖10可知，當料液比為1:2時，蛋白質和氨基酸的含量最高。

圖10 不同料液比對發酵結果的影響

2 結果與分析

2.1 金刺梨果渣發酵前各營養成分

金刺梨果渣發酵前各營養成分指標和含量見表2。

表2 金刺梨果渣發酵前營養成分

2.2 金刺梨果渣發酵后各營養成分

發酵以金刺梨果渣10g，尿素2%，接種量15%,料液比1∶2配制成固體培養基，然后將其進行發酵。發酵后，對金刺梨果渣發酵物再次進行營養成分測定，結果詳情見表3。

表3 發酵后金刺梨果渣營養成分含量

由表3可知，金刺梨果渣發酵物中的蛋白質含量和氨基酸含量在發酵后會增加，發酵后的總糖和維生素C的含量減少。

3 結論與討論

3.1 結論

本試驗選取產朊假絲酵母對金刺梨果渣進行發酵實驗探究，將金刺梨果渣制成固態培養基進行發酵，并對金刺梨果渣發酵前后的營養成分進行測定對比。結果顯示，發酵以金刺梨10 g，尿素2%，接種量15%，料液比1：2配制成固體培養基進行發酵4d。金刺梨果渣在發酵后蛋白質含量由7.62mg/g提高到17.21mg/g，提高了126%，總糖由14%下降到2.6%，維生素C由6.53 mg/g下降到1.87 mg/g下降了71%，總氨基酸4.682 mg/g提高到8.732 mg/g。提高了86.5%。金刺梨果渣發酵后蛋白質和氨基酸都得到提高，并且蛋白質和氨基酸都是蛋白飼料的重要指標。因此金刺梨通過發酵后是一種理想的蛋白飼料。

3.2 討論

就目前來說，金刺梨加工后留下的果渣，雖然也含有較高的氨基酸，維生素和礦物營養元素，但因其果渣處理工藝滯后，動物采食性差，大多數金刺梨加工廠都選擇將金刺梨果渣廢棄處理。將金刺梨果渣經過產朊假絲酵母發酵制成蛋白飼料后，蛋白質和氨基酸的含量得到大幅提高，并且產朊假絲酵母發酵制成蛋白飼料中含有甘露寡糖和β-葡聚，糖能激發或增強畜禽動物機體免疫功能。因此金刺梨果渣發酵蛋白飼料在畜禽動物中應用價值很高，且有助于解決我國飼料資源短缺的問題。

但因該工藝在初始研究階段，在動物生產性能、腸道功能、免疫能力和繁殖性能等方面的研究，也有待進一步開展，且在動物生產中的合理添加量及添加方式也需進行深入研究，以期促進金刺梨果渣在飼料產業中的廣泛應用。