殼寡糖對(duì)酒精誘導(dǎo)的新生大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷和凋亡因子的影響

王 斌，陳逸倫，夏文水

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122）

胎兒酒精譜系綜合征（fetal alcohol spectrum disorder，F(xiàn)ASD）的癥狀包括胎兒出生前后發(fā)育遲緩、面部缺損或畸變[1]、智力和行為障礙等[2]。大腦發(fā)育期的酒精暴露可以引起一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損害，是歐美國(guó)家可預(yù)防嚴(yán)重智力殘疾的主要誘因[3]，酒精暴露對(duì)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成多種影響，包括影響腦容量和神經(jīng)活動(dòng)的降低，損害基底神經(jīng)節(jié)，損害小腦、海馬和皮層等大腦區(qū)域的發(fā)育，從而破壞學(xué)習(xí)和記憶能力[4-5]。FASD目前無(wú)法根治，酒精對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害是永久的，臨床上多使用一般精神藥物進(jìn)行治療，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接進(jìn)行作用，但長(zhǎng)期應(yīng)用易引起明顯依賴(lài)性，對(duì)人體健康有明顯影響，因此尋找有效安全的治療方法十分重要。許多文獻(xiàn)表明酒精暴露會(huì)導(dǎo)致腦部神經(jīng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)[6]，并對(duì)認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生重要影響[7-8]，酒精通過(guò)激活神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑造成神經(jīng)元細(xì)胞非正常凋亡[9]。同時(shí)一些文獻(xiàn)表明酒精暴露導(dǎo)致的新生大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與胱天蛋白酶（caspase）-3的激活有關(guān)[10-11]，Caspase-3作為凋亡終端酶在凋亡細(xì)胞凋亡過(guò)程中被激活，一些研究表明酒精作為γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）激活劑能夠上調(diào)GABA水平[12-14]，影響神經(jīng)元的遷移，激活Caspase-3從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的非正常凋亡。

殼寡糖（chitooligosaccharide，COS）由β-1,4糖苷鍵連接N-乙酰氨基葡萄糖組成的堿性氨基寡糖，由于其良好的水溶性、易降解和極其微小的細(xì)胞毒性受到廣泛關(guān)注[15]。許多文獻(xiàn)表明COS具有的多種生理活性，如抗氧化[16]、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)[17]以及神經(jīng)活性等[18]。COS具有良好的血腦屏障穿透能力[19]，能夠直接到達(dá)大腦產(chǎn)生作用。COS對(duì)各種原因引起腦部神經(jīng)損傷的各種癥狀，如氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡都有一定程度的影響[20]，研究表明COS能夠影響體外體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)阿爾茨海默病腦損、谷氨酸鹽等引起的神經(jīng)性腦損傷都具有保護(hù)作用[21]。Jiang Maorong等對(duì)周?chē)窠?jīng)受損大鼠進(jìn)行COS干預(yù)，發(fā)現(xiàn)COS對(duì)周?chē)窠?jīng)細(xì)胞具有保護(hù)及促進(jìn)再生的作用[22]。Yang Yuming等對(duì)體外PC-12細(xì)胞神經(jīng)元進(jìn)行COS干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)COS處理后的PC-12細(xì)胞突觸生長(zhǎng)能力和細(xì)胞活性都得到提升，表明COS具有提高PC-12細(xì)胞神經(jīng)元分化能力[23]。Wu Wei等發(fā)現(xiàn)COS的干預(yù)改善了新生大鼠缺氧缺血性腦損傷，顯著降低了丙二醛（malondiadehyde，MDA）、乳酸水平，對(duì)減輕缺氧缺血造成的氧化應(yīng)激損傷有積極影響[24]。以往的文獻(xiàn)對(duì)酒精暴露對(duì)發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成影響的具體機(jī)制有過(guò)多種探索，但對(duì)酒精暴露所致腦神經(jīng)發(fā)育異常的抑制物質(zhì)研究較少，具體機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立成熟的FASD新生大鼠模型來(lái)研究酒精暴露所導(dǎo)致的新生大鼠大腦的氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，旨在探究COS能否抑制酒精暴露導(dǎo)致的發(fā)育中新生大鼠的腦部損傷及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

56只SPF級(jí)SD新生大鼠由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。

殼寡糖（平均分子質(zhì)量1 299 Da、脫乙酰度85%）實(shí)驗(yàn)室自制；95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇（藥用級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蒸餾水 屈臣氏飲用水有限公司；其他常用有機(jī)試劑及無(wú)機(jī)試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、MDA、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、苯甲磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride， PMSF）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、脫脂乳粉、Cleaved-Caspase-3抗體、Pro Caspase-3抗體、Bax抗體上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體、羊抗兔免疫球蛋白G（H+L） 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜美國(guó)Merck & Millipore公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescenc，ECL）試劑盒 上海天能有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4K15冷凍型離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨機(jī) 寧波新芝生物科技公司；Mini PROTEAN 3 cell型電泳儀、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；DM2000 LED顯微鏡德國(guó)徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和FASD模型建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，每籠放養(yǎng)4只，每天接受12 h黑暗/12 h光照，光照時(shí)間段為8∶00～20∶00，實(shí)驗(yàn)室室溫為（22±2）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守國(guó)際倫理學(xué)規(guī)范，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法通過(guò)江蘇省無(wú)錫市倫理審核，倫理審核編號(hào)：JN.No20190615S0070810 [159]。

參考文獻(xiàn)[25]建立FASD模型，具體步驟為：在新生大鼠出生后第4天（postnatal day 4，PD4），將SD新生大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、藥理組（COS）、模型組（Mod）及COS干預(yù)組（COS+Mod），每組14只，共56只，盡量保持每組都有相同數(shù)量的雌性和雄性。通過(guò)灌胃法進(jìn)行新生大鼠酒精給藥和COS干預(yù)。根據(jù)國(guó)家關(guān)于COS作為“食品新原料”的規(guī)定[26]，COS的每日推薦量為不高于0.5 g/d，換算成大鼠劑量為45 mg/（kgmb·d）。新生大鼠在PD4早上8點(diǎn)對(duì)各組進(jìn)行第1次灌胃，灌胃時(shí)將新生大鼠與母鼠分開(kāi)并測(cè)定體質(zhì)量，COS組和COS+Mod組分別給予4.5 mg/mL COS溶液（10 mL/kgmb·d），NC組和Mod組給予10 mL/kgmb·d蒸餾水，給藥周期為PD4～PD9。Mod組和COS+Mod組大鼠在PD5～PD9進(jìn)行酒精造模（給予5.25 g/（kgmb·d）乙醇[27]），連續(xù)5 d按照33 mL/kgmb·d給予體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液（用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（藥用級(jí)）配制），分兩次給予酒精，每次劑量相等，Mod組與COS+Mod組分別在COS給藥后90 min內(nèi)給予第一次酒精，2 h后給予第二次酒精，NC組和COS組給予等體積蒸餾水，每次灌胃完成后將新生大鼠歸還母鼠。

1.3.2 新生大鼠腦組織的采集、固定與觀察

各組新生大鼠在PD9時(shí)測(cè)定終體質(zhì)量，然后新生大鼠腹腔注射1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kgmb），麻醉后頸部脫臼處死，于冰上分離腦組織，測(cè)定腦組織質(zhì)量后凍存在－80 ℃下備用。

同時(shí)在PD9時(shí)每組隨機(jī)抽取3只大鼠，大鼠進(jìn)行腹腔注射1%的戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kgmb），麻醉后用磷酸緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 7.4）進(jìn)行心臟灌注，當(dāng)肝臟變白后用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注，灌注結(jié)束后頸部脫臼處死大鼠，于冰上分離腦組織。腦組織在4%甲醛溶液中固定24 h，隨后用無(wú)水乙醇和二甲苯進(jìn)行梯度處理，然后進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片后用于后續(xù)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，通過(guò)DM2000 LED顯微鏡對(duì)新生大鼠大腦海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.3.3 體質(zhì)量與腦器官指數(shù)測(cè)定

新生大鼠PD4～PD9每天測(cè)定并記錄體質(zhì)量，計(jì)算新生大鼠PD9時(shí)的腦器官指數(shù)（腦組織質(zhì)量與體質(zhì)量的比值×100%）。

1.3.4 腦組織氧化還原狀態(tài)的測(cè)定

取1.3.2節(jié)凍存在－80 ℃下的腦組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，用生理鹽水制備腦組織質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿，參考對(duì)應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦組織中SOD、MDA、GSH、T-AOC水平，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 免疫蛋白印跡法測(cè)定腦組織蛋白表達(dá)

取1.3.2節(jié)－80 ℃保存的腦組織0.1 g，經(jīng)1 mL RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，各組蛋白樣品（30 μg/孔）經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜（250 mA、1 h），經(jīng)TBST洗滌5 min后用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后用TBST洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次后一抗（Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3、Bax和Bcl/2均以1∶1 000 稀釋?zhuān)沪?actin以1∶5 000稀釋?zhuān)? ℃孵育12 h。然后用TBST洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次后用二抗室溫孵育1 h，再次經(jīng)TBST洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次。顯影前滴加ECL工作液于PVDF膜上進(jìn)行反應(yīng)，顯影拍照后計(jì)算目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶（β-actin）灰度值的比值進(jìn)行蛋白相對(duì)表達(dá)水平分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用GraphPad Prism 7繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS對(duì)酒精暴露下新生大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況及腦器官指數(shù)的影響

圖1A為PD4～PD9新生大鼠每天的體質(zhì)量增長(zhǎng)情況，COS組、Mod組、COS+Mod組大鼠每天的體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)都小于NC組，在大鼠PD6時(shí)，經(jīng)酒精灌胃后Mod組體質(zhì)量顯著低于NC組（P＜0.05）；在大鼠PD7～PD9時(shí)，Mod組體質(zhì)量極顯著低于NC組（P＜0.01）；在大鼠PD9時(shí)，COS+Mod組體質(zhì)量顯著高于Mod組（P＜0.05）。說(shuō)明酒精暴露導(dǎo)致新生大鼠出現(xiàn)發(fā)育緩慢，而COS干預(yù)可以改善新生大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況。由圖1B可知，Mod組腦器官指數(shù)最高，較NC組有極顯著提高（P＜0.01），腦器官指數(shù)增加可能與酒精暴露導(dǎo)致腦水腫有關(guān)。COS+Mod組較Mod組腦器官指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明COS可對(duì)酒精暴露造成的腦損傷有緩解作用。

圖1 PD4～PD9新生大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況及腦器官指數(shù)Fig. 1 Changes in body mass gain from PD4 to PD9 and brain organ index of neonatal rats

2.2 COS對(duì)酒精暴露下新生大鼠腦組織病理學(xué)的影響

圖2A為各組在PD9時(shí)新生大鼠的腦組織海馬區(qū)HE染色情況，可以看出Mod組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的固縮變形，細(xì)胞核深染難以辨認(rèn)，排列不規(guī)則，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死，細(xì)胞間隔變大。NC組與COS組神經(jīng)細(xì)胞則排列緊密，層次清除，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核清晰。COS+Mod組有小部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)固縮變形壞死情況，但大部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核可辨。從圖2B中可以看出，Mod組皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)固縮變形，排列混亂，可以看到部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)壞死變形。NC組與COS組神經(jīng)細(xì)胞則排列有序，層次清除，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核清晰。COS+Mod組有小部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)排列混亂，但大部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核可辨。說(shuō)明COS可對(duì)酒精暴露造成的腦神經(jīng)細(xì)胞變形壞死有緩解作用。

圖2 各組新生大鼠腦組織病理學(xué)圖（200×）Fig. 2 Histopathological image of neonatal rats brain tissue in each group (200 ×)

2.3 COS對(duì)酒精暴露導(dǎo)致新生大鼠腦組織氧化損傷的影響

由圖3可知，Mod組腦組織的SOD活力、GSH含量、T-AOC較NC組極顯著降低（P＜0.01），MDA含量則極顯著提高（P＜0.01）。COS+Mod組較Mod組的SOD活力、GSH含量、T-AOC顯著或極顯著提高（P＜0.05、P＜0.01），COS+Mod組的MDA含量較Mod組顯著降低（P＜0.05），COS組比NC組的SOD活力、GSH含量稍低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。從以上結(jié)果可以看出，COS可以緩解酒精誘導(dǎo)的新生大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷，提高其抗氧化能力和清除自由基能力。

圖3 COS干預(yù)對(duì)酒精暴露導(dǎo)致新生大鼠腦組織氧化損傷的影響Fig. 3 Effect of COS intervention on cerebral oxidative damage induced by alcohol exposure in neonatal rats

2.4 COS對(duì)酒精暴露下新生大鼠腦組織中Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3、Bax和Bcl/2相對(duì)表達(dá)水平的影響

利用蛋白免疫印跡法研究COS干預(yù)對(duì)在酒精暴露下新生大鼠腦組織中Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3、Bax和Bcl/2表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4A所示。如圖4B、C所示，各組新生大鼠腦組織中Cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平存在明顯差異，Mod組大鼠腦組織中Cleaved Caspase-3和Pro Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平較NC組顯著或極顯著增加（P＜0.05、P＜0.01）；COS+Mod組較Mod組大鼠腦組織中Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01）。NC組和COS組Cleaved Caspase-3和Pro Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，由此可知酒精暴露誘導(dǎo)發(fā)育中的新生大鼠大腦Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平升高，而COS干預(yù)大大降低了酒精暴露導(dǎo)致的Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3激活。進(jìn)一步分析COS對(duì)Bax和Bcl/2相對(duì)表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖4D、E所示，酒精暴露對(duì)Bax具有激活作用，Mod組腦組織Bax相對(duì)表達(dá)水平極顯著高于NC組（P＜0.01），而B(niǎo)cl/2相對(duì)表達(dá)水平則極顯著低于NC組（P＜0.01）。經(jīng)COS干預(yù)后，COS+Mod組腦組織Bax相對(duì)表達(dá)水平較Mod組極顯著降低（P＜0.01），Bcl/2相對(duì)表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。綜上，COS對(duì)酒精誘導(dǎo)的腦組織凋亡相關(guān)蛋白的激活有抑制作用。

圖4 COS對(duì)酒精暴露下新生大鼠Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3、Bax和Bcl/2相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of COS on the relative expression levels of cleaved caspase-3, pro-caspase-3, Bax and Bcl-2 in neonatal rats exposed to alcohol

3 討 論

在近20年來(lái)對(duì)酒精濫用對(duì)胎兒發(fā)育中的大腦產(chǎn)生有害影響的研究中，研究者們廣泛地使用酒精暴露新生大鼠模型（FASD動(dòng)物模型）。本實(shí)驗(yàn)采用FASD動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證COS緩解酒精暴露下的新生大鼠氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的能力。以往的許多文獻(xiàn)表明酒精可在腦生長(zhǎng)突增期時(shí)引起廣泛的神經(jīng)元細(xì)胞異常死亡[9]，這種大量的非正常神經(jīng)元死亡發(fā)生在人類(lèi)胎兒出生前3個(gè)月和出生后的前幾年，而大鼠腦生長(zhǎng)突增期則是在大鼠出生后幾天內(nèi)。通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，許多研究對(duì)酒精誘導(dǎo)發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞死亡的具體機(jī)制進(jìn)行了廣泛的探索，文獻(xiàn)表明在大腦發(fā)育過(guò)程中，酒精暴露可導(dǎo)致大量神經(jīng)元異常死亡，最常見(jiàn)的神經(jīng)元死亡模式是細(xì)胞凋亡[9]。酒精誘導(dǎo)發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是復(fù)雜的，可能與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、微RNA（microRNA，miRNA）被破壞、氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)炎癥以及凋亡相關(guān)蛋白的激活有關(guān)[28]。細(xì)胞凋亡的特征是形態(tài)學(xué)和生化變化，形態(tài)學(xué)改變包括染色質(zhì)凝結(jié)、膜泡形成、DNA片段化和凋亡小體形成。神經(jīng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要變化是Caspase-3被激活，Pro Caspase-3和Cleaved Caspase-3作為凋亡終端酶在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中起重要作用。酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡伴隨著與Caspase-3相關(guān)的固有凋亡通路的激活，包括Bax、Bcl/2和細(xì)胞色素c的上調(diào)/釋放，這與Pro Caspase-3和Cleaved Caspase-3的激活高度相關(guān)[11]。

COS是一種具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)活性和抗凋亡特性的天然寡糖[29]，具有良好的水溶性，易穿越血腦屏障。COS由于在結(jié)構(gòu)上含有羥基、氨基等活性基團(tuán)而具有強(qiáng)的抗氧化性，先前研究表明COS能降低生物體內(nèi)自由基水平，影響MDA、T-AOC、GSH、總巰基（total sulphur，T-SH）、非蛋白結(jié)合巰基（non-protein sulfhydryl，NP-SH）、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）水平，減少氧化應(yīng)激損傷[21-24]。此外，COS對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有明顯的治療作用，如周?chē)窠?jīng)損傷和腦創(chuàng)傷性損傷，以及阿爾茨海默病、帕金森病和新生兒缺氧缺血性腦損傷[30]等退行性神經(jīng)疾病。COS的神經(jīng)保護(hù)作用的保護(hù)機(jī)制有多種說(shuō)法[31]，如抗氧化（自由基抑制劑/清除劑）機(jī)制、抗炎機(jī)制、抗遺傳毒性、抗凋亡、基因表達(dá)調(diào)節(jié)；離子通道調(diào)節(jié)以及金屬離子螯合劑和調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等方式。劉貴娟等的研究表明羧甲基殼寡糖能夠緩解阿爾茨海默病模型大鼠中氧化應(yīng)激損傷，有效抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，降低大鼠大腦海馬區(qū)MDA和乙酰膽堿酯酶的水平，顯著提高SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活力[32]；戴雪伶等的研究表明COS可以明顯抑制H2O2引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡，影響乳酸脫氫酶釋放量及MDA含量，能夠使凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl/2的比值下降，通過(guò)影響凋亡蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到抗凋亡作用[33]。

本實(shí)驗(yàn)探究了COS是否可以通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激損傷和凋亡相關(guān)蛋白的激活來(lái)緩解酒精暴露誘導(dǎo)的新生大鼠腦部損傷。體質(zhì)量增長(zhǎng)的情況在一定程度上反映了新生大鼠的發(fā)育情況，腦器官指數(shù)是評(píng)價(jià)動(dòng)物大腦發(fā)育情況的重要指標(biāo)。酒精暴露下新生大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯比正常大鼠緩慢，腦器官指數(shù)也明顯增加。本研究中，COS干預(yù)可顯著提高體質(zhì)量增長(zhǎng)情況，降低腦器官指數(shù)。說(shuō)明COS干預(yù)可以對(duì)酒精誘導(dǎo)導(dǎo)致的新生大鼠生長(zhǎng)發(fā)育和腦部發(fā)育滯緩有積極影響。HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精暴露可使新生腦組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生病理性改變，而COS干預(yù)可有效緩解新生腦組織生理?yè)p傷。新生兒腦耗氧量高，抗氧化能力弱，新生兒大腦易受氧化應(yīng)激引起的組織損傷，最終導(dǎo)致腦部損傷，COS干預(yù)可明顯提高T-AOC水平，同時(shí)降低MDA水平，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量是對(duì)氧化應(yīng)激最敏感的指標(biāo)之一，MDA可引起膜通透性增加、ATP活力降低，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。對(duì)于酒精暴露下的新生大鼠，COS干預(yù)可上調(diào)GSH水平和SOD活力，對(duì)維持新生兒神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育起重要作用。本實(shí)驗(yàn)還研究了COS是否可以通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的激活表達(dá)來(lái)緩解酒精暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)凋亡。結(jié)果表明，酒精暴露增加了Cleaved Caspase-3、Pro Caspase-3和Bax的表達(dá)，抑制了Bcl/2的激活表達(dá)。此外，與Mod組相比，COS干預(yù)有效抑制了Cleaved Caspase-3和Pro Caspase-3的表達(dá)，抑制了Bax表達(dá)的激活和Bcl/2的下調(diào)。這與Xu Wei等[20]體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行COS干預(yù)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相似，其結(jié)果表明COS能夠穩(wěn)定線粒體膜電位，提高Bcl/2/Bax的比值，抑制Pro Caspase-3的激活表達(dá)，并且能夠提高Akt和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2激活表達(dá)，抑制葡萄糖剝奪引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外，Zhou Songlin等對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行COS干預(yù)，研究結(jié)果表明COS能夠抑制谷氨酸鹽誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞中Pro Caspase-3的激活表達(dá)，緩解海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21]。因此，本研究結(jié)果表明COS可能通過(guò)抑制Caspase-3相關(guān)凋亡通路的激活來(lái)抑制酒精暴露所導(dǎo)致的新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上，本研究表明COS可以通過(guò)減輕酒精暴露誘導(dǎo)的新生大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷和抑制Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的激活來(lái)抑制酒精暴露所導(dǎo)致的新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷，然而，COS緩解酒精誘導(dǎo)神經(jīng)凋亡的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以圍繞COS對(duì)Caspase-3相關(guān)凋亡通路的影響開(kāi)展研究。