濃香型白酒大曲生產(chǎn)園區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及影響因素研究

陳識(shí)澳，饒家權(quán)，文 靜，李佳鑫，龔利娟*，馬振兵，周麗紅，呂麗茹

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.四川省釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644005；3.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 遂寧 629209)

大曲是白酒生產(chǎn)不可缺少的發(fā)酵劑，大曲中的微生物主要來(lái)源于環(huán)境[1-2]。周天慈等[3]對(duì)新大曲微生物來(lái)源的研究發(fā)現(xiàn)，新大曲中大量微生物來(lái)源于原料、室內(nèi)器具以及室外地面。Du等[4]在類似的研究中發(fā)現(xiàn)新大曲中有82 %的細(xì)菌來(lái)源于原料，10%來(lái)源于室內(nèi)外地面，2%來(lái)源于室內(nèi)空氣。然而這些研究均是對(duì)制曲車間室內(nèi)環(huán)境的研究，缺乏對(duì)于外環(huán)境的研究。制曲車間不是封閉的空間，人員的活動(dòng)和空氣的流通均會(huì)帶動(dòng)物質(zhì)和微生物的流動(dòng)，外環(huán)境土壤中的微生物也可通過制曲工具、人員活動(dòng)、風(fēng)力、浮塵等進(jìn)入大曲，進(jìn)而影響大曲品質(zhì)。

為了解濃香型白酒制曲園區(qū)土壤細(xì)菌群落組成情況，進(jìn)一步探究制曲活動(dòng)對(duì)土壤微生態(tài)的影響。本研究分別對(duì)制曲園區(qū)內(nèi)距離制曲車間不同距離的土壤微生物群落特征進(jìn)行了分析，旨在加深對(duì)制曲環(huán)境的了解，探究土壤中微生物群落分布與制曲生產(chǎn)活動(dòng)的互作關(guān)系，為生態(tài)釀造環(huán)境保護(hù)以及新建制曲車間選址提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置和樣品采集

采樣時(shí)間為夏季8月，在制曲園區(qū)內(nèi)環(huán)繞制曲車間設(shè)置3個(gè)取樣圈。第一圈(近距離，J)為最靠近制曲車間廠房土壤，第三圈(遠(yuǎn)距離，Y)為園區(qū)內(nèi)離制曲車間最遠(yuǎn)區(qū)域土壤，第二圈(中距離，Z)介于第一圈和第三圈之間，各圈之間相距約200m。每圈設(shè)置12個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)在10m2范圍內(nèi)采用“五點(diǎn)取樣法”采集10～20cm深度處土壤，采樣時(shí)除去土壤表面動(dòng)植物殘?bào)w，每個(gè)樣點(diǎn)采集約500g土壤，充分混勻后用無(wú)菌塑料袋于 4℃保溫箱保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定。

1.2 理化性質(zhì)測(cè)定

混勻后的樣品取一部分放置風(fēng)干處理，用于理化性質(zhì)測(cè)定。土壤含水量(Moisture content，MC)采用烘干法測(cè)定；pH使用pH計(jì)測(cè)定；土壤容重(Soil bulk density，SBD)采用環(huán)刀法測(cè)定；有機(jī)碳含量(Total organic carbon content，TOC)采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定；土壤全氮含量(Total nitrogen content，TN)采用凱氏定氮法測(cè)定；水有效磷含量(Available Phosphorus content，AP)采用鉬銻抗分光光度法測(cè)定；速效鉀含量(Available potassium content，AK)用四苯硼鈉比濁法測(cè)定。

1.3 土壤DNA提取及PCR擴(kuò)增

每圈層12個(gè)土樣每相鄰3個(gè)土樣混合為一個(gè)混合樣品，用于總DNA提取，共計(jì)12個(gè)混合土樣。土壤總DNA提取使用購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp Soil DNA Kit試劑盒，按照操作步驟進(jìn)行。引物使用ArBa515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增V3-V4高變區(qū)；PCR反應(yīng)體系采用Pro Taq ,20 μL反應(yīng)體系：2×Pro Taq 10 μl; Forward Primer(5 μm)0.8 μm；Reverse Primer5 μm)0.8 μl；Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O直20 μl。PCR參數(shù)為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止，隨后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得Clean Data，序列拼接使用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags，然后利用軟件USEARCH(v7.0.1090)將拼接好的Tags在97 %相似度下聚類，得到OTU的代表序列，再通過RDP classifer(v2.2)軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)有比對(duì)進(jìn)行物種注釋，注釋數(shù)據(jù)庫(kù)為Silva V119。置信度閾值設(shè)置為0.8，將所得結(jié)果以最小樣品序列數(shù)抽平，然后進(jìn)行后續(xù)分析。

理化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 23進(jìn)行，理化數(shù)據(jù)組間差異使用單因素ANOVA檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)定為0.05；Mothur 1.30用于Alpha(α)多樣性指數(shù)分析，使用豐富度指數(shù)Chao指數(shù)和多樣性指數(shù)Shnnon指數(shù)分析土壤微生物的alpha多樣性;使用R 3.3.1語(yǔ)言vegan包進(jìn)行NMDS(Non-metric multidimensional scaling)及冗余分析(Redundancy analysis，RDA)并繪圖，使用stat包進(jìn)行屬水平組間差異物種分析，將顯著差異物種按序列數(shù)繪制熱圖并進(jìn)行聚類，使用vegan包將聚類后的種群和理化因素進(jìn)行Mantel tests分析。

2 分析與討論

2.1 制曲園區(qū)土壤理化性質(zhì)分析

不同距離的土壤理化性質(zhì)差異較大(表1)。近距離土壤全氮、有效磷、速效鉀含量均顯著高于遠(yuǎn)距離土壤；有機(jī)碳含量中距離土壤最高，近距離土壤次之。整體來(lái)看，土壤營(yíng)養(yǎng)水平與距離呈負(fù)相關(guān)。近距離土壤情況為緊實(shí)度高，含水量低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富；中距離土壤pH低，水分含量高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富；遠(yuǎn)距離土壤pH高而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較缺乏。可見制曲活動(dòng)影響了制曲車間附近土壤的理化性質(zhì)。

表1 制曲園區(qū)土壤理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以最小序列數(shù)樣品為基準(zhǔn)抽平后，各樣品平均序列數(shù)為76198，制曲園區(qū)土壤共檢測(cè)出39個(gè)門，124個(gè)綱，290個(gè)目，419個(gè)科，643個(gè)屬細(xì)菌。在屬水平構(gòu)建物種累計(jì)曲線(Species accumulation curves，SAC)和稀釋曲線(Rarefaction curve，RC)見圖1。結(jié)果顯示，隨著測(cè)序樣品的增加，出現(xiàn)新細(xì)菌屬的數(shù)量逐漸減少，第12個(gè)樣品時(shí)不再出現(xiàn)新屬，說(shuō)明測(cè)序樣品數(shù)量較為充足；隨著測(cè)序深度的增加各樣品稀釋曲線逐漸平緩，說(shuō)明測(cè)序深度合理。

圖1 屬水平SAC和RC

2.3 土壤細(xì)菌群落α多樣性分析

近距離土壤細(xì)菌豐富度(Chao指數(shù))顯著低于中、遠(yuǎn)距離，土壤細(xì)菌豐富度與距制曲車間的距離正相關(guān)；遠(yuǎn)距離土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)最高，但不同距離土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)差異不顯著(表2)。近距離土壤細(xì)菌群落受到更嚴(yán)重的篩選，從遠(yuǎn)距離到近距離土壤細(xì)菌群落可能是一個(gè)選擇性富集的過程。周森在研究中發(fā)現(xiàn)，從曲房室外的地面到曲房?jī)?nèi)環(huán)境微生物多樣性逐漸降低，由此提出曲房室外到曲房室內(nèi)是微生物菌種選擇性富集的過程[5]，土壤細(xì)菌從遠(yuǎn)距離到近距離可能也是一個(gè)類似的選擇性富集過程。

表2 土壤細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)

2.4 制曲園區(qū)土壤群落組成結(jié)構(gòu)分析

分別統(tǒng)計(jì)制曲園區(qū)土壤門水平和屬水平的優(yōu)勢(shì)菌(圖2-a)。在門水平上，不同距離土壤優(yōu)勢(shì)菌種類相同，均以變形桿菌門(Proteobacteria)酸桿菌門(Acidobacteriota)和浮霉菌門(Planctomycetota)為主，三者累計(jì)相對(duì)豐度超過50 %。其中變形桿菌門酸桿菌門均是土壤中常見的細(xì)菌[6]。近距離土壤優(yōu)勢(shì)菌群所占總比例最高，近距土壤浮霉菌門和Methylomirabilota相對(duì)豐度高于其他區(qū)域，Methylomirabilota相對(duì)豐度與距離負(fù)相關(guān)，而遠(yuǎn)距離土壤Gemmatimonadota相對(duì)豐度最高；近距離土壤優(yōu)勢(shì)菌群所占總比例最高，這體現(xiàn)了微生物的選擇性富集。在屬水平上，不同距離土壤優(yōu)勢(shì)菌見圖2-b，優(yōu)勢(shì)屬主要包括g_norank_f_Vicinamibacteraceae、g_norank_f_Gemmatimonadaceae(芽單胞菌科)、小梨形菌屬(Pirellula)、g_norank_f_Gemmataceae(出芽菌科)；近、中距離土壤富集了更高豐度的小梨形菌屬、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas、Candidatus_Udaeobacter、Candidatus_Xiphinematobacter，而遠(yuǎn)距離土壤Nitrospira、norank_f_Gemmatimonadaceae相對(duì)豐度最高。從優(yōu)勢(shì)菌的角度來(lái)看，與制曲車距離的增加改變了優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度，而沒有使得優(yōu)勢(shì)菌種類發(fā)生變化。

圖2 制曲園區(qū)土壤門水平和屬水平優(yōu)勢(shì)菌群

2.5 不同距離土壤細(xì)菌群落差異及影響因素分析

NMDS用于分析群落間的相似性和差異性，分析結(jié)果stress=0.145，NMDS模型較好(圖3-a)。結(jié)果顯示不同距離土壤群落差異顯著(R=0.468)，近、中距離土壤細(xì)菌群落組成更相似。RDA用于分析影響細(xì)菌群落組成的理化因素(圖3-b)，結(jié)果顯示，土壤理化性質(zhì)共解釋了74.9 %的細(xì)菌群落差異，其中pH和全氮含量顯著影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，解釋率分別為19.5%(P=0.022)、15%(P=0.03)；速效鉀含量對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響也較大(表3)。可見土壤理化性質(zhì)顯著影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而pH、全氮和速效鉀含量共同起著主導(dǎo)作用，這與前人的研究結(jié)果相似[7]。pH通過影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用、胞外酶的產(chǎn)生和分泌等影響微生物群落結(jié)構(gòu)[8]。

圖3 屬水平NMDS及RDA分析

表3 RDA分析結(jié)果

2.6 不同距離土壤細(xì)菌差異物種分析

為了探究制曲活動(dòng)對(duì)制曲園區(qū)土壤微生物種類的影響，在屬水平上，使用Kruskal-Wallis H test對(duì)不同距離土壤進(jìn)行組間差異分析，得到了15種各組間相對(duì)豐度差異顯著的菌屬(P<0.05)，然后按序列數(shù)繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析，詳見圖4。聚類分析將15種差異菌屬劃分為G1(Group 1)，G2(Group 2)，G3(Group 3)3個(gè)群體，G1代表在遠(yuǎn)距離土壤富集的菌屬，包括norank_f_Gemmatimonadaceae，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、unclassified_f_Polyangiaceae、Alterococcus。Group 2(G2)：代表在中距離土壤富集的菌屬包括norank_f_Methyloligellaceae、Phenylobacterium和Stenotrophobacter。Group 3(G3)：代表在近距離壤中富集的菌屬。

圖4 不同距離土壤差異菌屬分析

2.7 差異菌屬與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

為了探究不同距離土壤差異菌屬的影響因素，對(duì)3個(gè)代表菌群(G1-G3)與理化性質(zhì)進(jìn)行Mantel tests分析，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，速效鉀含量是造成遠(yuǎn)距離土壤產(chǎn)生差異菌屬的主要理化因素，有機(jī)碳含量是造成中距離土壤產(chǎn)生差異菌屬的主要理化因素，近距離土壤差異菌屬則受pH、有效磷和速效鉀含量共同作用。此外，pH與土壤全氮、有機(jī)碳含量顯著負(fù)相關(guān)，有效磷與速效鉀含量顯著正相關(guān)。可見造成不同距離土壤菌屬差異的理化因素不盡相同，近距離土壤菌屬受pH、有效磷和速效鉀含量影響顯著，中距離土壤菌屬則主要受有機(jī)碳含量影響，因此，針對(duì)不同的區(qū)域應(yīng)采取不同的防控保護(hù)措施。

圖5 差異菌屬與理化性質(zhì)Mantel tests

3 結(jié)論

制曲車間不是密閉的空間，空氣、人員等的流動(dòng)等帶動(dòng)制曲車間物質(zhì)和微生物的轉(zhuǎn)移，影響土壤理化性質(zhì)以及土壤微生物群落。制曲原料在運(yùn)輸、生產(chǎn)過程中的灑落以及人員流動(dòng)頻繁是近距離土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)顯著高于其他區(qū)域的主要原因，而近距離土壤豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)大了優(yōu)勢(shì)菌群的優(yōu)勢(shì)(優(yōu)勢(shì)菌所占比例與距離負(fù)相關(guān))，優(yōu)勢(shì)菌群大量繁殖造成近距離土壤細(xì)菌Chao指數(shù)降低(表2)，而制曲活動(dòng)使得Chthoniobacter、Candidatus_Xiphinematobacter等菌屬在制曲車間附近富集。本研究發(fā)現(xiàn)，制曲活動(dòng)對(duì)土壤微生物的影響隨距離的增加而減弱，從近距離到遠(yuǎn)距離，細(xì)菌群落差異逐漸增大，近中距離細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，這種相似性具體體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)菌所占的比例和差異菌屬相對(duì)豐度相近上。因此，在曲車間附近一定的范圍如中距離范圍(200m)內(nèi)建立生態(tài)保護(hù)區(qū)域，避免農(nóng)業(yè)和其他工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)的進(jìn)行，對(duì)于保護(hù)制曲生態(tài)環(huán)境有著重要意義。

制曲活動(dòng)帶動(dòng)制曲園區(qū)的物質(zhì)流動(dòng)，影響了土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響了土壤微生物的種類及相對(duì)豐度，而制曲活動(dòng)對(duì)土壤的影響與距離負(fù)相關(guān)；制曲車間附近(近距離)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，細(xì)菌豐富度較低；通過RDA分析確定了影響制曲園區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化因素是pH、全氮含量和速效鉀含量。研究加深了對(duì)制曲環(huán)境的認(rèn)識(shí)，為釀酒、制曲生態(tài)環(huán)境保護(hù)和新廠區(qū)選址提供了研究方向和理論依據(jù)。