靜原雞胸肌與腿肌肌苷酸特異性沉積相關基因的生物信息學分析

趙 薇 曹國偉 王衛振 鄧占釗 張 娟* 顧亞玲 虎紅紅 黃增文

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021； 2.彭陽縣畜牧技術推廣服務中心，寧夏 固原 756000； 3.西昌學院 動物科學學院，四川 西昌 615000)

禽肉已成為我國的第二大消費肉品，其需求量呈逐年增加趨勢。近年來，肉雞生長速度顯著提高，但肉品質量卻顯著下降。因此，改善肉質風味，培育肉質優良、風味獨特的優質地方雞種成為現代畜禽分子育種的主要研究方向。研究表明，肌苷酸(Inosine monphosphate, IMP)是畜禽肉質風味與滋味的主要基礎物質，雞肉中IMP含量越高，肉質風味越好。雞肉烹飪時，IMP與其他的化學物質發生美拉德反應，產生各種揮發性芳香化合物，增強了甜味，抑制了食物中的酸味和苦味。IMP與谷氨酸鈉具有很強的協同作用，兩者以1∶(5～20) 的比例混合后鮮味顯著提高。因此，國內外學者對雞肉中IMP沉積的機制開展了大量研究。目前已發現，不同品種、飼養方式、飼養環境以及營養水平等因素均對IMP特異性沉積有很大影響。靜原雞IMP沉積與腺苷酸激酶1(Adenylate kinase 1,

AK1

)mRNA表達的相關性研究中發現，

AK1

mRNA在公雞胸肌中的表達與IMP含量呈負相關，在公雞腿肌中的表達與IMP含量呈正相關。相反，

AK1

mRNA在母雞胸肌和腿肌中的表達與IMP含量呈顯著正相關，可作為IMP沉積的候選基因。在5個品系的韓國土雞進行IMP與肌苷的研究中發現，母雞體內IMP含量高于公雞且母雞胸肌中IMP含量高于腿肌。在肉雞中，IMP水平隨著嘌呤核苷酸飼料的補充而大大提高，這些飼料添加劑通過影響酶活性來調節IMP水平，說明添加外源性嘌呤核苷酸對促進IMP的沉積，進而改善雞肉風味。王一冰等發現林養模式可提高清遠麻雞胸肌中谷氨酸與IMP的含量，改善肉品質。

課題組前期高效液相色譜檢測發現靜原雞胸肌中IMP和肌苷的含量均顯著高于腿肌中的IMP和肌苷的含量。上述研究僅從表型和轉錄組學分析影響IMP沉積，不足以深入揭示IMP的沉積機制。因此，本研究通過LC-MS/MS技術對靜原雞胸肌和腿肌進行蛋白質組測序，以期篩選出調控IMP沉積的關鍵差異蛋白，并對差異蛋白對應基因進行RT-qPCR驗證和生物信息學分析。這為進一步對候選標志性蛋白在IMP特異性沉積機制中的功能研究奠定基礎，也為優良地方雞種的遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用靜原雞均來自寧夏回族自治區固原市彭陽縣朝那雞繁育中心，選擇具有相同遺傳背景同批孵化的靜原雞雛雞，所用雞在統一條件下飼養管理至180日齡，屠宰前12 h禁食，放血屠宰后采集15只靜原雞母雞的胸腿肌組織樣，迅速放入液氮罐中帶回實驗室并放置在-80 ℃冰箱中備用。肌苷酸IMP和肌苷含量均采用高效液相色譜法，于2019年在寧夏昊標檢測服務研究院測定(表1)。

表1 靜原母雞IMP含量與肌苷含量
Table 1 Content of IMP and inosine in Jingyuan chicken g/kg

組織Tissue肌苷酸含量IMP content肌苷含量Inosine content3.6300.129胸肌Pectoralismuscle3.7300.2532.8600.2110.8200.154腿肌Leg muscle0.6200.1270.8600.176

1.2 差異蛋白相關基因的RT-qPCR驗證

用天根生化科技有限公司總RNA提取試劑盒提取總RNA，1%凝膠電泳檢測總RNA完整性。根據NCBI數據庫提供的雞乙酰輔酶A酰基轉移酶2 (Acetyl-CoA acyltransferase 2,

ACAA2

)、短鏈烯脂酰輔酶A水合酶1 (Short-chain enoyl coenzyme A hydratase 1，

ECHS1

)、短鏈酰基輔酶a脫氫酶(Short chain acyl coenzyme a dehydrogenase，

ACADS

)、長鏈酰基輔酶A脫氫酶(Long chain acyl coenzyme A dehydrogenase，

ACADL

)、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶2(Carnitine O-palmitoyltransferase 2，

CPT2

)、長鏈酯酰輔酶A合成酶(Long chain ester acyl coenzyme A synthetas，

ACSL1

)、M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase,

PKM2

)、磷酸葡萄糖變位酶(α-D-phosphate glucose converting enzyme 1,

PGM1

)以及肌動蛋白(

β

-

actin

)的mRNA序列，通過Primer Premier 5.0軟件設計基因的引物，并由中科羽瞳技術服務有限公司合成，引物序列見表2。

表2 基因引物序列
Table 2 Primer sequences of broilers

基因Gene基因登錄號Gene entry number引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')退火溫度/℃Annealingtemperature產物長度/bpProductlengthACAA2NM_001006571.2F: AAAGCACAGCCTCACTCCR: CAAATGCCTCGTTCACC57.5164ACADLNM_001006511.2F: AGGTTTGCTGGGTGTTGR: AGTTGACGTACATCTGCTCC57.598ACSL1NM_0010125781F: CCTTCCGACAAATACCCR: GCATCCTCTTCACCCTC57.5138ACADSNM_001006193.1F: CCTCTTCCACTGCCAACCR: TGCCAATCCTTCCTCCAT57.5129CPT2NM_001031287.2F: GAAGGTAAGCCCAGATGCR: TGGACGGTTCCCTAACAA57.5188ECHS1NM_001277395.1F: GTCCGTCAATGCTGCTTTCGR: CGGTCGTCGGTGGCAAA57.590PKM2NM_205469.1F: TCGCACAGAAGATGATTGR: CACAGCCTCCAGTGGGTAG57.5207PGM1NM_001038693.2F: CAGATACGACTATGAGGAGGTGR: CAAAGCAGCGGTCAAACA57.586β-actinL08165F: ATGGACTCTGGTGATGGTGTTACR: TCGGCTGTGGTGGTGAAG57.5158

本研究采用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀(Mx3 000P)進行RT-qPCR試驗，擴增總體系為20 μL。其中Bester SYBR Green qPCR master Mix 10.0 μL，PCR Forward Primer(10.0 μmol/L)0.6 μL，PCR Reverse Primer(10.0 μmol/L)0.6 μL，cDNA模板1.1 μL，RNase Free HO 7.8 μL。擴增程序：95 ℃ 2 min， 95 ℃ 3 s， 65 ℃ 30 s，38個循環，每個樣品重復3次。

1.3 篩選IMP合成相關差異表達蛋白

根據前期蛋白質組測序，腿肌與胸肌比較組間以差異倍數值變化超過1.5倍作為顯著上調、小于1/1.5作為顯著下調來篩選差異表達蛋白。并運用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) (https:∥www.kegg.jp/kegg/pathway.html)與基因本體論(Gene Ontology, GO)(http:∥geneontology.org/)篩選出與IMP合成高度相關的差異表達蛋白。

1.4 IMP合成相關差異表達蛋白的GO、KEGG分析和蛋白網絡互作分析

對篩選得到的差異表達蛋白進行生物信息學分析。利用KEGG和GO分析出差異表達蛋白富集的通路，以及差異表達蛋白參與的生物學過程、細胞組分和分子功能。將差異表達蛋白與STRING(v.10.5)(https:∥string-db.org/)蛋白網絡互作數據庫比對后，設置置信度為0.9 得到差異蛋白互作關系。

1.5 差異表達蛋白對應基因相對表達量與IMP的相關性分析

為了確定差異表達蛋白是否與IMP合成相關，運用SPSS 25.0對差異表達蛋白對應基因和IMP進行相關性分析。

1.6 數據處理

采用Microsoft Excle 軟件2方法計算基因相對表達水平，并對差異顯著性進行單因素方差分析，其中

P

<0.05表示差異顯著，

P

<0.01表示差異極顯著；利用SPSS 25.0對差異表達蛋白對應基因和IMP含量的相關性進行雙變量相關性分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質組數據相關基因的表達量分析

以胸肌作為對照組，腿肌作為試驗組，相對表達量分析結果顯示，

ACAA2

、

ECHS1

、

ACADS

、

ACADL

、

CPT2

和

ACSL1

呈明顯的上調趨勢，而

PKM2

和

PGM1

呈明顯的下調趨勢(圖1)，這與前期蛋白質組數據結果一致，表明測序結果可靠，可用于后期功能驗證(表3)。此外，單因素方差分析顯示，胸肌和腿肌中

ACAA2

、

ACADL

、

CPT2

、

ACSL1

、

PKM2

和

PGM1

基因的表達量差異極顯著(

P

<0.01)，

ECHS1

和

ACADS

基因的表達量差異顯著(

P

<0.05)。

*P<0.05表示差異顯著；**P<0.01表示差異極顯著。 *P<0.05 indicates significant difference； **P<0.01 indicates extremely significant difference.圖1 差異蛋白相關基因RT-qPCR比較分析Fig.1 Differential protein related genes RT-qPCR

表3 蛋白質組差異蛋白的測序分析
Table 3 Sequencing analysis of differential proteome proteins

蛋白描述Protein description基因名稱Gene name調節型Regulated typeTJ/XJ P值TJ/XJ P value乙酰輔酶A酰基轉移酶2Acetyl-coenzyme A acyltransferase 2ACAA2Up0.014 679短鏈烯脂酰輔酶A水合酶1Short-chain enoyl coenzyme A hydratase 1ECHS1Up0.000 704短鏈酰基輔酶a脫氫酶Short chain acyl coenzyme a dehydrogenaseACADSUp0.014 481長鏈酰基輔酶A脫氫酶Long chain acyl coenzyme A dehydrogenaseACADLUp0.006 280肉毒堿棕櫚酰基轉移酶2Carnitine O-palmitoyltransferase 2CPT2Up0.020 600長鏈酯酰輔酶A合成酶Long chain ester acyl coenzyme A synthetasACSL1Up0.003 735M2型丙酮酸激酶M2 pyruvate kinasePKM2Down0.000 102磷酸葡萄糖變位酶α-D-phosphate glucose converting enzymePGM1Down0.000 115

2.2 IMP合成相關差異表達蛋白的GO、KEGG分析和蛋白網絡互作分析

對差異蛋白質進行GO功能分析和KEGG通路富集分析顯示，差異蛋白主要富集在糖酵解/糖異生途徑、脂肪酸代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝途徑和PPAR信號轉導等20個途徑，其中嘌呤代謝是IMP合成的主要途徑。因此在嘌呤代謝通路中篩選出可能與IMP合成相關的候選基因

PKM2

和

PGM1

(圖

2

)。對

PKM2

和

PGM1

參與的KEGG通路和GO功能分析發現，

PKM2

基因涉及6個通路，主要參與嘌呤代謝通路、糖酵解/糖異生通路和氨基酸生物合成等通路中；

PGM1

基因涉及7個通路，主要參與糖酵解/糖異生、核酸、蛋白質及脂類代謝等通路(表4)；

PKM2

和

PGM1

基因參與的生物學過程、細胞組分和分子功能見表5。對

PKM2

和

PGM1

進行蛋白網絡分析(置信度0.9)，結果顯示，

PKM2

與

ENO4

、

GAPDH

等11個蛋白相互作用，

PGM1

與

PGM2

、

TKT

等10個蛋白相互作用(圖3)。

2.3 差異表達蛋白對應基因相對表達量與IMP含量的相關性分析

相關性如表6所示，靜原雞胸肌

PKM2

mRNA表達量與IMP含量呈負相關性(

r

=-0.171 0)，腿肌

PKM2

mRNA表達量與IMP含量呈極顯著正相關(

r

=0.735 0)(

P

<0.01)，胸肌和腿肌

PKM2

mRNA表達量與肌苷含量呈顯著正相關(

r

=0.479 9和0.655 7)(

P

<0.05)；胸肌和腿肌

PGM1

mRNA表達量與IMP含量均呈極顯著負相關(

r

=-0.536 2和-0.512 5)(

P

<0.01)，胸肌

PGM1

mRNA表達量與肌苷含量呈顯著正相關(

r

=0.309 7)(

P

<0.05)，腿肌

PKM2

mRNA表達量與肌苷含量呈顯著正相關(

r

=0.570 4)(

P

<0.05)。

圖2 差異表達蛋白在嘌呤代謝通路中的位置Fig.2 Position of differentially expressed proteins in purine metabolic pathway

表4 和參與的KEGG通路
Table 4 Enrichment analysis of and KEGG pathway

基因名稱Gene name登錄號Registration numberKEGG富集通路KEGG enrichment pathwaygga00010糖酵解和糖異生Glycolysis/Gluconeogenesisgga00230嘌呤代謝Purine metabolismPKM2gga00620丙酮酸代謝Pyruvate metabolismgga01100代謝途徑Metabolic pathwaysgga01200碳代謝Carbon metabolismgga01230氨基酸的生物合成Biosynthesis of amino acids

表4(續)

基因名稱Gene name登錄號Registration numberKEGG富集通路 KEGG enrichment pathway gga00010糖酵解和糖異生Glycolysis/Gluconeogenesisgga00030磷酸戊糖途徑Pentose phosphate pathwayPGM1gga00052半乳糖代謝Galactose metabolismgga00230嘌呤代謝Purine metabolismgga00500淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolismgga00520氨基糖和核苷酸糖的代謝Amino sugar and nucleotide sugar metabolism

表5 和參與的GO功能分析
Table 5 GO function enrichment analysis of and

基因名稱Gene name登錄號Registration number描述Description條目類型Item typeGO: 0006757ADP產生ATPATP generation from ADP生物學過程Biological processGO: 0009116核苷代謝過程Nucleoside metabolic process生物學過程Biological processGO: 0042278嘌呤核苷代謝過程Purine nucleoside metabolic process生物學過程Biological processGO: 0006165二磷酸核苷磷酸化Nucleoside diphosphate phosphorylation生物學過程Biological processGO: 0046031ADP的代謝過程ADP metabolic process生物學過程Biological processGO: 0019362吡啶核苷酸代謝過程Pyridine nucleotide metabolic process;生物學過程Biological processGO: 0006096糖酵解過程Glycolytic process生物學過程Biological processGO: 0009167嘌呤核糖核苷單磷酸代謝過程Purine ribonucleoside monophosphate metabolic process生物學過程Biological processGO: 0009117核苷酸代謝過程Nucleotide metabolic process生物學過程Biological process

表5(續)

基因名稱Gene name登錄號Registration number描述Description條目類型Item typeGO: 0044699單組織的過程Single-organism process生物學過程Biological processGO: 0043229細胞內的細胞器Intracellular organelle細胞組分Cellular componentGO: 0005929纖毛Cilium細胞組分Cellular componentGO: 0044421細胞外區域部分Extracellular region part細胞組分Cellular componentGO: 0042995細胞投影Cell projection細胞組分Cellular componentGO: 0005737細胞質Cytoplasm細胞組分Cellular componentPKM2GO: 0031982囊泡Vesicle細胞組分Cellular componentGO: 0044424細胞內的部分Intracellular part細胞組分Cellular componentGO: 0005829胞質Cytosol細胞組分Cellular componentGO: 0005623細胞Cell細胞組分Cellular componentGO: 0005576細胞外區域Extracellular region細胞組分Cellular componentGO: 0000287鎂離子結合Magnesium ion binding分子功能Molecular functionGO: 0003723核糖核酸結合RNA binding分子功能Molecular functionGO: 0004743丙酮酸激酶活性Pyruvate kinase activity分子功能Molecular functionGO: 0016773磷酸轉移酶活性,醇基為受體,大分子復雜的結合Phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor分子功能Molecular functionGO: 0044877Macromolecular complex binding分子功能Molecular functionGO: 0043167離子結合Ion binding分子功能Molecular function

表5(續)

基因名稱Gene name登錄號Registration number描述Description條目類型Item typeGO: 0030955鉀離子結合Potassium ion binding分子功能Molecular functionGO: 0005515蛋白結合Protein binding分子功能Molecular functionGO: 0003823抗原結合Antigen binding分子功能Molecular functionGO: 1901363雜環化合物結合Heterocyclic compound binding分子功能Molecular functionGO: 0008152代謝過程Tabolic process生物學過程Biological processGO: 0005975碳水化合物代謝過程Carbohydrate metabolic process生物學過程Biological processGO: 0044238主要代謝過程Primary metabolic process生物學過程Biological processGO: 0071704有機物代謝過程Organic substance metabolic process生物學過程Biological processGO: 0000287鎂離子結合Magnesium ion binding分子功能Molecular functionPGM1GO: 0016853異構酶的活性Isomerase activity分子功能Molecular functionGO: 0005488催化活性Catalytic activity分子功能Molecular functionGO: 0016868結合Binding分子功能Molecular functionGO: 0043167分子內轉移酶活性Intramolecular transferase activity分子功能Molecular functionGO: 0046872離子結合Ion binding分子功能Molecular functionGO: 0043169金屬離子結合Metal ion binding分子功能Molecular functionGO: 0016866陽離子結合Cation binding分子功能Molecular function

表6 靜原雞胸肌和腿肌、表達量與IMP、肌苷含量的相關性
Table 6 Correlation of 、 expression with IMP and inosine content in breast muscle and leg muscle of chickens

部位Part項目Project相關系數 Correlation coefficientPKM2PGM1胸肌Pectoralismuscle肌苷酸IMP-0.171 0-0.536 2**肌苷Inosine0.479 9*0.309 7*腿肌Leg muscle肌苷酸IMP0.735 0**-0.512 5**肌苷Inosine0.655 7**0.570 4**

注：*表示差異顯著(<0.05)；**表示差異極顯著(<0.01)。

Note: *<0.05 indicates significant difference；** <0.01 indicates extremely significant difference.

3 討 論

課題組前期高效液相色譜檢測發現靜原雞胸肌中IMP和肌苷的含量均顯著高于腿部肌肉中IMP和肌苷的含量，這與劉望夷等研究結果相同。同時，對靜原雞胸肌與腿肌進行蛋白質組測序分析，通過篩選差異表達蛋白，進而篩選出調控IMP特異性沉積的關鍵基因。對其進行生物信息學分析，篩選到關鍵基因

PKM2

和

PGM1

顯著富集到合成IMP的嘌呤代謝途徑、糖酵解/糖異生途徑和氨基酸的生物合成途徑。IMP從頭合成需要一碳單位、ATP、CO、天冬氨酸、谷氨酸和五磷酸焦磷酸等原料，因此推測出

PKM2

和

PGM1

與IMP特異性沉積有密切聯系。同時，GO和KEGG分析篩選到AMP脫氨酶、丙酮酸激酶-2、磷酸葡萄糖變位酶-1和腺苷酸激酶同工酶等4種差異表達蛋白，進一步篩選出

AMPD1

、

PKM2

、

PGM1

和

AK1

與IMP合成相關的關鍵基因，這幾種基因均涉及嘌呤代謝、糖酵解/糖異生和氨基酸生物合成等通路，這與Donoghue等的研究結果相符。此外，靜原雞胸肌

PKM2

的相對表達量與IMP含量均呈負相關；腿肌

PKM2

的相對表達量與IMP含量呈正相關，胸肌和腿肌組織中

PGM1

的相對表達量與IMP含量均呈負相關。

PKM2

是糖酵解的最終限速酶，其參與磷酸烯醇式丙酮酸向ATP的轉移。它將磷酸烯醇式丙酮酸和ADP轉化為丙酮酸和ATP，表明

PKM2

的表達水平決定糖代謝速率和ATP的產生。此外，

PKM2

可以通過氧化、磷酸化或乙酰化等修飾方式從酶活性高的四聚體降解為二聚體或單體，作為核轉錄因子在細胞核中發揮作用。本研究發現

PKM2

基因參與ADP產生ATP、糖酵解/糖異生和核苷酸代謝等眾多過程，這說明

PKM2

在細胞核和細胞質中參與能量代謝過程，產生ATP和AMP，進而合成IMP。這與Zhang等的研究結果一致。目前認為

PKM2

有阻斷葡萄糖代謝的作用，使其進入磷酸戊糖代謝、糖醛酸代謝、多元醇代謝等代謝途徑，合成五碳核糖和非必需氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)。有研究顯示，腺苷一磷酸脫氨酶3(Adenosine monophosphate deaminase 3,

AMPD3

)可催化AMP合成IMP，和

PKM2

雙缺陷的小鼠紅細胞ATP、ADP和AMP水平顯著升高。而AMP的合成需要天冬氨酸和IMP為原料，這從側面證明了本研究中腿肌IMP沉積量低于胸肌IMP沉積量可能與胸肌中

PKM2

和

AMPD3

的含量有密切關系，后期可進行細胞功能驗證深入研究。

PGM1

屬于α- D -磷酸葡萄糖轉換酶超家族，是哺乳動物細胞碳水化合物代謝的關鍵調控因子，其通過雙磷酸化糖中間體α-D -葡萄糖-1,6-二磷酸鹽催化α- D -葡萄糖-1-磷酸和α-D-葡萄糖-6-磷酸之間的可逆轉化。在磷酸戊糖途徑中葡萄糖-6-磷酸在

PGM1

作用下生成核糖-5-磷酸，其與ATP生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖，進而生成IMP，說明

PGM1

對IMP沉積有重要作用。本研究發現

PGM1

參與碳水化合物代謝等過程，表明

PGM1

通過參與磷酸戊糖途徑來間接合成IMP，這與Li等的研究結果一致。綜上所述，可以推測

PKM2

和

PGM1

可能是調控IMP沉積的關鍵基因。然而，目前利用單一組學研究IMP沉積的潛在機制是有限的，多組學聯合分析可深入挖掘調控IMP的關鍵候選基因，更加全面了解其作用機制，改善雞肉質性狀。

4 結 論

本研究基于蛋白質組測序對靜原雞胸肌和腿肌組織IMP特異性沉積進行研究，篩選出調控IMP沉積的差異表達蛋白對應基因

PKM2

和

PGM1

，并對其進行生物信息學分析，發現

PKM2

和

PGM1

基因與IMP的合成有密切聯系。本研究表明，

PKM2

和

PGM1

可能是影響雞肉IMP含量的關鍵基因，為提高雞肉風味，促進地方品種資源的開發利用提供科學依據。