改性紅棗多糖的制備和結構表征

楊燕敏，鄭振佳，李桂芹，張仁堂*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018；2.濱州職業學院生物工程學院，山東 濱州 256603）

紅棗又稱大棗，原產于中國，是鼠李科植物棗的成熟果實[1]。紅棗作為一種食藥同源產品[2]，含有多酚類物質、五環三萜類化合物、黃酮、活性多糖和環磷酸腺苷等多種生物活性物質。因此，具有免疫調節、護肝、補血、抗衰老和抗癌等功效，在人體保健和疾病防治方面發揮重要作用[3]。

多糖大量存在于動物、植物以及微生物中，由于其優良的生物活性，在食品和醫藥行業廣泛應用。天然多糖的結構復雜，結構類型明顯多于蛋白質，但是多糖復雜的結構和各種生物活性機制導致其在醫藥和食品添加劑領域的應用存在許多缺陷。當前，通過對多糖改性進行分子修飾的方法，不僅可以獲得不同結構類型的多糖衍生物，而且有可能改變多糖的理化特性及生物功能，是發現和研制新型多糖類藥物的重要途徑[4]。目前已有報道的多糖改性化學方法有羧甲基化[5]、磷酸化[6]、硫酸酯化[7]、乙酰化[8]和硒化[9]等，通過對多糖進行分子修飾，不僅使多糖結構更加穩定，還可以增強功能活性。焦中髙[10]研究了紅棗多糖的硫酸酯化修飾、羧甲基修飾、乙酰化修飾的理化特性以及抗氧化、降血糖等生物活性，結果表明改性修飾后的多糖均可改善其在水溶液中的分布狀態，提高其溶解性。對紅棗多糖適度硫酸酯化修飾可以增強其對超氧陰離子自由基的清除活性；對紅棗多糖羧甲基化修飾和乙酰化修飾可顯著提高其羥基自由基清除活性，不同取代基修飾均降低了紅棗多糖對α淀粉酶的抑制活性，但可增強其對α葡萄糖苷酶的抑制活性，其中尤以羧甲基化修飾的效果最好。

本文通過對哈密大棗多糖進行硫酸改性、羧甲基改性和硒化改性，研究其改性前后結構變化，為進一步研究紅棗多糖改性后功能活性和應用途徑提供理論參考，為紅棗多糖的產業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗：新疆哈密大棗，市售。

濃硫酸（優級純）、苯酚、葡萄糖、無水乙醇、石油醚（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；正丁醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250（均為分析純）：上海奧博生物科技有限公司；單糖標準品阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、Dextranstandards 1152標準品（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；多糖分子量測定標品（5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da）：美國西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器與設備

754N紫外可見分光光度計：上海奧普勒儀器有限公司；1836型烏氏黏度計：臺州市椒江玻璃儀器廠；UV-2450紫外可見分光光度計、LC-10A高效液相色譜儀：日本島津公司；KQ500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ThermoFisherICS-5000+高效陰離子交換色譜儀、Nicole iS10型紅外光譜儀：美國Thermo Fisher科技公司；ZEISS-SUPRATM 55型掃描電子顯微鏡：德國卡爾蔡司公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制備

1.3.1.1 紅棗多糖的提取純化

將紅棗去核切片，置于60℃烘箱中干燥，粉碎后過40目篩網，加入蒸餾水使料液比為1∶10（g/mL）進行回流提取。100℃煮沸后浸提45 min，浸提2次，合并多糖提取液，濃縮后醇沉，冷凍干燥后備用[11]。用石油醚和粗多糖溶液按1∶1體積比充分混勻，用分液漏斗分離脫脂，重復3次。將粗多糖溶液和Sevag試劑（氯仿和正丁醇體積比4∶1）按4∶1體積比加入，強烈振蕩，靜置分層后離心棄去下清液及中間夾雜的變性蛋白[12]，重復7次，通過透析去除小分子雜質，濃縮后凍干得純化多糖，將其命名為紅棗多糖，用于后續試驗。

1.3.1.2 紅棗多糖的羧甲基化改性

取1.0g多糖在劇烈攪拌下懸浮于40mL異丙醇中30min，再加入3 mol/L的NaOH 20 mL，20℃攪拌1 h，加入2.5 g氯乙酸在60℃下反應4 h，冷卻至20℃，用3 mol/L HCl中和，透析醇沉凍干得羧甲基化紅棗多糖[13]。采用酸堿滴定法測定羧甲基化多糖的取代度[14]。

1.3.1.3 紅棗多糖的硫酸法改性

將30 mL濃硫酸和10 mL正丁醇按3∶1體積比在冰水浴下混合，加入 125 mg（NH4）SO4，使溶液冷卻至0℃以下，加入1.0 g多糖，攪拌30 min，加入3 mol/L NaOH，調pH值為7，醇沉后透析，凍干得硫酸化紅棗多糖[15]。采用硫酸鋇濁度法測樣品中硫的含量，在360nm波長下，用K2SO4建立標準曲線[16]。

1.3.1.4 紅棗多糖的硒化改性

取1.0g多糖放入250mL三角燒瓶中，加入100mL 0.5%硝酸溶液，水浴加熱到70℃，加入0.8 g Na2SeO3和1.44 g BaCl2，70℃水浴6 h，冷卻至室溫25℃，過濾去沉淀，用無水碳酸鈉調pH值為7。加1.4 g Na2SO4，離心取上清后透析，取透析上清加抗壞血酸，若變紅，則繼續透析，顏色不變則透析結束，凍干得硒化紅棗多糖[17]。用紫外分光光度法測定硒元素含量[18]。

1.3.2 多糖含量和蛋白質含量測定

以葡萄糖為標準品，采用苯酚硫酸法[19]測定多糖含量。以牛血清白蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法[20]測定多糖中蛋白質含量。

1.3.3 光譜分析

1.3.3.1 紫外光譜分析

配制濃度為1 mg/mL多糖溶液，置于石英比色皿，在190 nm～400 nm波段下進行掃描，觀察在260 nm處有無核酸吸收峰和280 nm有無蛋白質吸收峰，以檢測雜質是否去除干凈[21]。

1.3.3.2 紅外光譜分析

將多糖樣品粉末均勻附著于樣品臺上，使用傅立葉紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內掃描，并使用OMNIC軟件分析結果[22]。

1.3.4 單糖組成分析

通過高效陰離子交換色譜儀分析4個樣品的單糖組成，準確稱取10 mg的多糖，在80℃下用4 mL 2.0 mol/L三氟乙酸水解6 h，去除殘留的三氯乙酸，用超純水定容至10 mL，并通過Supelclean ENVI-18固相萃取管和0.22 μm超濾管澄清。在30℃下以NaOH（0.20 moL/L）溶液作為流動相以0.25 mL/min的流速分析樣品。

1.3.5 分子量的測定

精密稱取樣品和標準品，樣品配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用 0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉置于1.8 mL進樣小瓶中。色譜柱：BRT105-104-102串聯凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動相：0.05 mol/LNaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40℃；進樣量：20 μL；檢測器：示差檢測器 RI-502。

1.3.6 多糖樣品的表面特征分析

利用ZEISS-SUPRATM55型掃描電子顯微鏡觀察多糖樣品的表面形態。將多糖樣品粉末均勻附著于樣品臺上，置于離子濺射儀中進行真空鍍金，在高真空條件下掃描樣品。

1.3.7 相對黏度測定

配制1 mg/mL多糖溶液，整個試驗流程將烏氏黏度計放在（25±0.5）℃條件下，將多糖溶液倒入烏氏黏度計中恒溫15 min，測定多糖溶液從烏氏黏度計上刻度線流到下刻度線所需時間T1，以去離子水做對照，相同條件下所需時間T，T1/T即為多糖溶液在25℃條件下為濃度1 mg/mL的相對黏度[18]。

1.3.8 統計學分析

所有試驗均重復3次，數據以平均值±標準差表示，采用Origin2017進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 紅棗多糖改性前后的理化性質分析

紅棗多糖改性衍生物取代度、得率及化學成分見表1。

表1 紅棗多糖改性衍生物取代度、得率及化學成分Table 1 Substitution degree，yield and chemical composition of jujube polysaccharide modified derivatives

由表1可知，硫酸化紅棗多糖取代度較高，為1.65，但得率較低，為59.15%。羧甲基化紅棗多糖取代度較低，為0.42，但是得率最高，為91.1%。硒化紅棗多糖得率為 68.8%，硒元素含量為（580.15±11.96）μg/g。紅棗多糖中蛋白質含量最高，為1.49%，多糖含量也最高，為49.96%。而羧甲基化紅棗多糖、硫酸化紅棗多糖和硒化紅棗多糖的多糖含量和蛋白質含量均有所降低，這可能是由于改性時酸性環境引起多糖和蛋白質降解以及新官能團引入，與童微等[23]的研究結果一致。紅棗多糖的分子量為136 413 Da，羧甲基化紅棗多糖的重均分子量為46 637 Da，硒化紅棗多糖的重均分子量為136 153 Da，而硫酸化紅棗多糖為兩個洗脫峰，重均分子量分別為9 970 Da和6 149 Da。改性后多糖分子量均有所減小，硒化紅棗多糖改性后分子量和改性前相差不大，硫酸化紅棗多糖改性后分子量和改性前相差最大，表明硫酸改性時多糖發生了強烈降解。

2.2 光譜分析

2.2.1 紫外全波長掃描

紅棗多糖的紫外掃描圖譜見圖1。

圖1 紅棗多糖的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectrum of jujube polysaccharide

如圖1所示，紅棗多糖在280nm處有明顯吸收峰，說明含有蛋白質雜質，其他多糖組分280 nm處沒有明顯多糖吸收峰，說明蛋白質含量少，結果和蛋白質含量測定結果一致。

2.2.2 紅外光譜

紅棗多糖的紅外圖譜見圖2～圖5。

圖2 紅棗多糖的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectrum of jujube polysaccharide

圖3 羧甲基化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.3 FT-IR spectrum of carboxymethylated jujube polysaccharide

圖4 硫酸化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.4 FT-IR spectrum of sulfated jujube polysaccharide

圖5 硒化紅棗多糖的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of selenized jujube polysaccharide

由圖2～圖5可知，改性前后的多糖紅外光譜在3 265.75 cm-1～3 382.72 cm-1范圍內均有強吸收峰，是多糖分子間或分子內的O-H的伸縮振動引起的；在2 935.20 cm-1～2 958.83 cm-1均出現了弱吸收峰，是糖類不對稱C-H伸縮振動。羧甲基化紅棗多糖在1 640 cm-1處的信號為C=O的非對稱伸縮振動，1 420 cm-1處的信號為次甲基的伸縮振動，這兩個吸收峰附近是羧甲基的特征吸收峰，與紅棗多糖紅外光譜相比明顯增強，說明發生了羧甲基化反應[24]，各硫酸衍生物中均有硫酸根的特異吸收峰。硫酸化紅棗多糖在1 212.46 cm-1處的信號為S=O的非對稱伸縮振動，和紅棗多糖紅外光譜相比明顯加寬，對應于酯硫酸鹽基團，825.09 cm-1處的峰值，對應于C-O-S對稱性拉伸振動[25]。將硒化紅棗多糖與紅棗多糖紅外光譜進行比較，硒化紅棗多糖在1 416.89 cm-1吸收峰增大，為糖環上與Se=O相鄰的C-H特征吸收峰[26]。

2.3 單糖組成

單糖組成分析結果見表2。

表2 單糖組成分析結果Table 2 Analysis results of monosaccharide composition%

由表2可知，紅棗多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成，其比例為33.83%和48.17%；硫酸化紅棗多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和半乳糖醛酸組成，其比例為21.31%、27.38%、7.22%、13.58和30.57%；羧甲基化紅棗多糖由阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成，其比例為38.03%、22.37%和39.60%；硒化紅棗多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖醛酸組成，其比例為22.28%和53.23%。

2.4 電鏡結果

多糖掃描電鏡見圖6。

圖6 多糖掃描電鏡圖片Fig.6 Scanning electron microphotograph of polysaccharide

由圖6可知，紅棗多糖呈不規則片狀，表面相對平整光滑，結構致密。羧甲基化紅棗多糖在100倍下的表面形態都呈分散、單片狀分布，表明紅棗多糖的規則纖維狀結構被破壞，結構疏松，變為不規則的層狀，在500倍和2 500倍下可看到其表面形狀規則的圓形小孔[27]。硫酸化紅棗多糖表面不平整，說明硫酸酯化修飾可以改變多糖的表面形態，使其顆粒變小，表面粗糙，形態更為復雜[28]。硒化紅棗多糖有許多條形寬度不一的條形彎曲，放大后表面光滑，觀察到圓形空洞[29]。

2.5 多糖的黏度

采用烏氏黏度計測量多糖的相對黏度，結果顯示，在多糖濃度為10 mg/mL且溫度為25℃條件下，紅棗多糖的相對黏度最高，達到3.29，硒化紅棗多糖的相對黏度為2.83，羧甲基化紅棗多糖的相對黏度為1.57，硫酸化紅棗多糖的相對黏度為1.04。

3 結論

本研究采用硫酸改性、羧甲基改性以及硒化改性方法對紅棗多糖進行改性，硫酸改性和羧甲基改性的多糖含量顯著降低。硫酸化紅棗多糖的取代度為1.65，羧甲基化紅棗多糖的取代度為0.42。硒化紅棗多糖多糖中硒元素含量為（580.15±11.96）μg/g。高效凝膠滲透色譜法分析表明硫酸化紅棗多糖的分子量變化最顯著，其次是羧甲基化紅棗多糖。多糖改性后仍具有多糖特征吸收峰，綜合多糖取代度、紅外光譜、分子量、單糖組成以及掃描電鏡等多方面的結果分析，表明這3種改性方法對紅棗多糖理化性質和結構有較大影響，可以得出多糖改性成功的結論。本研究為紅棗多糖今后的衍生化修飾提供了一定的理論參考，但是多糖改性的最優工藝參數以及改后的生物活性有待于進一步研究。