不同提取方式對黃姜姜油揮發性成分的影響

徐菁，李杰，劉曉燕，2*

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州 貴陽 550005）

黃姜為姜科（Zingiberaceae）姜屬（Zingiber）植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的塊莖[1]，又名小種姜，有利膽、健胃止嘔、消水腫的作用，與蜂蜜合用對肝病恢復有益[2]。姜油是生姜的提取物，其揮發性成分為生姜的主要風味物質，在醫藥和食品方面具有廣泛的應用空間。

目前姜油提取方式主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界二氧化碳提取法、超聲波法、壓榨法等[3-4]。鑒于不同提取方式對姜油的揮發性成分影響不同，本研究采用現代提取方法（超臨界二氧化碳提取法）和傳統提取法（水蒸氣蒸餾法和溶劑提取法）3種方法提取黃姜姜油，采用高效、快速的氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrum association，GCMS）作為檢測姜油揮發性成分的方法，運用主成分和聚類分析對樣品中揮發性物質進行分析、比較，旨在進一步全面了解黃姜姜油中的揮發性成分，探討研究能較完整保留姜油揮發性成分的提取方法，并通過ABTS+自由基、DPPH自由基和羥基自由基清除試驗證明其抗氧化活性，旨在為其生物活性的進一步研究提供試驗依據，對指導實際生產具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜樣品：現采新鮮貴州省安順市鎮寧縣黃姜，清洗干凈后切片置于50℃烘箱中烘干，打碎，過60目篩后密封保存備用。

石油醚、無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；活性白土植物油脫色澄清劑：樂平市元昶膨潤土有限公司；30%過氧化氫、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）：成都金山化學試劑有限公司；水楊酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：北京瑞泰科技有限公司；抗壞血酸（純度≥99.7%）：國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

循環水真空泵（SHB-III）：鄭州長城科工貿有限公司；智能高低溫循環水器（FCL6-20）：濟南海能儀器股份有限公司；電熱恒溫干燥箱（202-1AB）：天津市泰斯特儀器有限公司；多功能粉碎機（CS-2000）：永康市天祺盛世國貿有限公司；電子天平（DJ-A500）：福州華志科學儀器有限公司；紫外分光光度儀（UV-2550）：日本島津公司；超臨界萃取裝置（HA420-50-06）：南通市華安超臨界萃取實業公司；氣相色譜-質譜聯用儀GCMS（9000-7000D）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 姜油的提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾法

稱取50g姜粉按照料液比1∶10（g/mL）加入500mL蒸餾水，浸泡2 h，于蒸餾裝置中提取7 h[5]。提取液倒入分液漏斗，取上層油狀物，以活性白土植物油脫色澄清劑為除色劑，在25℃下進行除色，循環水真空泵進行抽濾，姜油置于避光玻璃器皿內。提取率計算公式如下[6]。

式中：X為姜油提取率，%；m為姜油質量，g；M為姜原料質量，g。

1.3.1.2 溶劑提取法

稱取50g姜粉按照料液比1∶10（g/mL）加入500mL的石油醚，于索氏提取器內60℃回流提取，至索氏提取器內液體澄清透明或圓底燒瓶內油液混合物不再減少為止[7]，提取液進行旋蒸，去除提取液中多余的石油醚和水，以活性白土植物油脫色澄清劑為除色劑，在25℃下進行除色，循環水真空泵進行抽濾，收集揮發油并稱重，提取率計算同水蒸氣蒸餾法。

1.3.1.3 超臨界二氧化碳提取法

稱取50 g姜粉放入超臨界萃取裝置中，25 MPa、40℃萃取條件下萃取3h，提取率計算同水蒸氣蒸餾法。

1.3.2 GC-MS檢測

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：高純He 0.8 mL/min；柱箱溫度：75℃保持1 min；5℃～150℃，2℃/min；150℃～280℃，5℃/min，保持 5 min。進樣方式：進樣口 260 ℃；分流比 100∶1，進樣 1 μL。質譜條件：離子源溫度230℃；MS傳輸線260℃；掃描范圍10 amu～800 amu。

1.3.3 姜油抗氧化活性研究

參考楊事維[8]方法，稍作改動。在具塞刻度試管中加入不同質量濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL）姜油溶液1 mL，依次加入2 mL FeSO4（6.0 mmol/L）溶液、3 mL水楊酸-乙醇溶液（9.0 mmol/L），再加入2 mL H2O2（9.0 mmol/L）溶液，搖勻，此時將試管移入37℃水浴鍋中反應30 min，反應結束后，以無水乙醇作為調零液，在510 nm處測定其吸光度，即為A1，在相同條件下，以純水代替H2O2，在510 nm處測定其吸光度，為A2。空白組以無水乙醇代替樣品，在510 nm處測定其吸光度，即為A0，以VC作為陽性對照，按下列公式計算羥基自由基清除率。

式中：A0為樣品空白組（FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2+無水乙醇）；A1為樣品組吸光度（樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+H2O2）；A2為樣品對照組吸光度（樣品+FeSO4+水楊酸-乙醇溶液+純水）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考陸占國等[9]的方法，稍作改動。DPPH配制成1.0×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液，用95%乙醇分別配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL 姜油溶液。分別取2.0 mL樣品液和2.0 mL的DPPH溶液（1 mmol/L）混合均勻，暗處放置0.5 h，以95%乙醇作參照，測定吸光度A；2.0 mL樣品液與2.0 mL 95%乙醇混合后測定吸光度A0；2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇混合液測定吸光度A1。以上吸光度均在517 nm測定，清除率計算公式如下。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參照段斌等[10]的方法，稍作改動。將ABTS溶液（7 mmol/L）和 K2S2O8溶液（2.45 mmol/L）等體積混合，并搖勻，陰暗放置13 h～16 h，將ABTS溶液用95%乙醇溶液進行稀釋，直至吸光度為0.70±0.02。取0.2 mL姜油，加入3.8 mL ABTS溶液，在吸光度為734 nm下進行測定，測定吸光度A，測定ABTS溶液的吸光度A0，清除率計算公式如下。

1.3.4 數據處理與分析

以GC-MS鑒定出的3種提取方法中各個化學成分的峰面積為指標，用SPSS 26.0軟件對3種提取方法所鑒定出所有化合物進行主成分分析和聚類分析。

卷包車間和咀棒車間是煙草企業的最關鍵生產環節，需要對其生產流程進行詳細的調研，將生產的全過程進行控制。保證生產的順利進行，提高生產效率以及產品質量。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法下姜油的揮發性成分

3種方法所得姜油的提取率以及分離鑒定的化合物數見表1。

表1 3種提取方法姜油提取率以及化合物數比較Table 1 Comparison of yield and compound number of ginger oil by three extraction methods

由表1可以得出，超臨界二氧化碳提取法的提取率要高于水蒸氣蒸餾法和溶劑法，經GC-MS分析所得3種提取方法的總離子色譜圖分別見圖1、圖2和圖3。

圖1 超臨界二氧化碳提取姜油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by supercritical carbon dioxide

圖2 水蒸氣蒸餾法提取姜油總離子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by steam distillation

圖3 水蒸氣蒸餾法提取姜油總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of ginger oil extracted by steam distillation

由圖1、圖2和圖3可知，超臨界二氧化碳提取法共鑒定出48種化合物，水蒸氣蒸餾法共鑒定出39種化合物，溶劑提取法共鑒定出45種化合物。采用面積歸一法測定3種提取方式所得姜油揮發性成分各組分相對含量，結果見表2。

表2 不同提取方式下姜油揮發性成分相對含量Table 2 Relative content of volatile components in ginger oil under different extraction

續表2 不同提取方式下姜油揮發性成分相對含量Continue table 2 Relative content of volatile components in ginger oil under different extraction

參考吳林芬等[11]的分析方法，比較分析表1和表2中3種不同提取方法提取的姜油揮發性組分在成分和含量上都存在一部分差異，其中超臨界二氧化碳提取法較小，水蒸氣蒸餾法和溶劑提取法的差異較大，表明這3種不同提取方法對姜油的提取效果是不一樣的。在超臨界二氧化碳提取姜油的提取物中，含量較高的揮發性化合物主要是萜烯類、醇類、酮類和酯類化合物；在水蒸氣蒸餾法提取姜油的提取物中，含量較高的揮發性化合物主要是萜烯類、脂類、醇類和酮類化合物；溶劑萃取法提取姜油的提取物中，含量較高的化合物主要是萜烯類、脂類、醇類和酮類化合物。3種提取方法的組成基本相同，但組分之間的相對含量存在差異，水蒸氣蒸餾法提取的少量化合物損失較大，且部分全部損失。比較3種提取方式的數據可以看出，3種提取方法鑒定物質中有38種是共有的，其中超臨界二氧化碳提取的姜油揮發性成分相對于其他兩種方式提取的揮發性成分保留的較完整，因萜烯組分對姜的風味特征貢獻較大[12]，從物質的組成而言，超臨界二氧化碳提取保留了姜原有的辛辣風味[13]。

2.2 主成分分析（principal components analysis，PCA）

對GC-MS所鑒定的共有38種化合物進行編號（1～38）后，采用SPSS 26.0進行主成分分析，以共有化合物的峰面積為指標進行分析，分析結果見表3。

表3 特征值與貢獻值Table 3 Eigenvalue and contribution rate

根據特征值大于1的原則[14-15]，由表3可知，共分析得兩個主成分，貢獻率分別為94.269%和5.731%，累計貢獻率達100%。故前兩個主成分能很好地代表38種姜油揮發性成分的信息，因此選取前兩個主成分繼續后續的成分分析。主成分因子的特征向量與載荷矩陣見表4。

表4 主成分因子的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and load matrices of principal component factors

由表4可知，主成分1中部分化合物載荷量相同，反映的指標與芳樟醇、松油醇、反式-2-辛烯-1-醇、香葉醇、羥基香茅醇、橙花醇乙酸酯、β-蓽澄茄烯、依蘭烯、可巴烯、γ-萜品烯、α-萜品烯、7-表-α-己烯呈高度正相關，與β-環檸檬醛、姜酮、癸醛呈高度負相關，對主成分1貢獻最大的是松油醇、香葉醇、羥基香茅醇、β-蓽澄茄烯、橙花醇乙酸酯，它們的載荷量都為1.000，對主成分1貢獻最小的是姜酮，載荷量為-0.993；主成分2反映的主要指標與α-蒎烯、γ-蓽橙茄烯，與α-蒎烯、γ-蓽橙茄烯、γ-衣蘭油烯、莰烯呈正高度相關，與欖香烯和辛醛等呈負相關，主成分2貢獻最大的是γ-蓽橙茄烯，載荷量為0.997，載荷量最小的是辛醛，載荷量為-0.192。綜合上述分析姜油中重要揮發性物質有松油醇、香葉醇、羥基香茅醇、β-蓽澄茄烯、橙花醇乙酸酯、γ-蓽橙茄烯，可以歸結為醇類物質、烯類物質以及其他物質等，可以用這幾項指標來評價黃姜姜油揮發性成分的組成。

2.3 聚類分析

以3種提取方法所鑒定出共有38種化合物的峰面積為指標，采用SPSS 26.0進行組間聚類分析，結果見圖4。

圖4 不同提取方法提取姜油鑒定的揮發性成分聚類圖Fig.4 Cluster diagram of volatile components identified by different extraction methods of ginger oil

參考文獻中[16-18]的分析方法，根據主成分分析結果，以38種化合物為指標劃分距離，當距離為5時，38種化合物被聚為2類，姜烯為一類，其余37種化合物聚為一類。雖然聚類分析分類與主成分分析分類結果一致，但也存在一定的差異，說明不同提取方法對姜油揮發性成分存在影響。

2.4 超臨界二氧化碳法提取的姜油抗氧化活性分析

2.4.1 超臨界二氧化碳法提取的姜油對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩定性高，并且可以長時間保存的自由基，經常被用作測試抗氧化性的試劑[19]。姜油對DPPH自由基的清除能力見圖5。

圖5 姜油對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of ginger oil on DPPH free radical

由圖5可知，對照組VC和姜油均對DPPH自由基表現出了清除能力。姜油對DPPH自由基清除率與濃度存在著一定的正相關性，且清除率上升明顯，當濃度超過0.08 mg/mL時，清除率的上升趨勢有所減緩。VC在試驗濃度范圍內，清除率均在90%以上，總體來說，超臨界二氧化碳法提取的姜油對DPPH自由基具有良好的清除能力。

2.4.2 超臨界二氧化碳法提取的姜油對ABTS+自由基的清除能力

ABTS法是使用最普遍的測量抗氧化劑抗氧化的比色法[20]。超臨界二氧化碳法提取的姜油對ABTS+自由基的清除能力見圖6。

圖6 姜油對ABTS+自由基清除能力Fig.6 Scavenging effect of ginger oil on ABTS+free radical

由圖6可知，對照組VC和姜油對ABTS+自由基均具備清除能力。當VC濃度低于0.06 mg/mL時，其ABTS+自由基清除率隨著濃度的升高逐漸增大，且各個濃度的清除率上升變化明顯，當濃度為0.06 mg/mL時，自由基清除率達到了88.85%，之后隨著濃度的提高，自由基清除水平處于平衡。姜油對ABTS+自由基的清除率，隨著濃度的升高而增大，最大濃度的清除率達到71.04%。總體來說，超臨界二氧化碳法提取的姜油對ABTS+自由基具有良好的清除能力。

2.4.3 超臨界二氧化碳法提取的姜油對羥基自由基的清除能力

超臨界二氧化碳法提取的姜油對羥基自由基的清除能力見圖7。

圖7 姜油對羥基自由基清除能力Fig.7 Scavenging effect of ginger oil on hydroxyl radical

由圖7可知，姜油在較低濃度下對羥基自由基的清除效率較低，隨著濃度的增加清除率逐漸升高[21]，在濃度為0.12 mg/mL時清除率達到最大值29.62%，在試驗劑量濃度范圍內，VC清除羥基自由基的效果明顯高于姜油對羥基自由基的清除效果[22]。總體來說，超臨界二氧化碳法提取的姜油對羥基自由基具有較好的清除能力。

3 結論

采用超臨界二氧化碳提取、溶劑法和水蒸氣蒸餾法3種不同提取方法，以氣相色譜-質譜聯用技術為檢測方法結合計算機軟件Masshunter和譜庫NIST MS Search 2.2進行對比分析。其中，超臨界二氧化碳提取法提取率為4.80%，共鑒定出48種化合物；水蒸氣蒸餾法提取率為2.12%，共鑒定出39種化合物；溶劑法提取率為3.95%，共鑒定出45種化合物。3種提取方法所鑒定出的化合物組成基本相同，但組分之間存在明顯差異，其中姜酚類含量因水蒸氣提取及溶劑法皆需高溫加熱，所以姜酚類含量皆比超臨界二氧化碳低。超臨界二氧化碳提取的具有揮發性成分相對于另兩種，揮發性成分保留的較完整。對GC-MS所鑒定的3種姜油中共有的38種化合物進行主成分分析，可分為2個主成分，黃姜姜油的主要揮發性物質可以歸結為醇類物質、烯類物質以及其他物質等，可以用這幾項指標來評價黃姜姜油揮發性成分的組成。在聚類分析時將化合物聚類為2類是具有可行性的，姜烯為一類，其余37種化合物為一類，雖然分析結果與主成分分析的結果存在一定的差異，但仍可說明不同提取方法對姜油揮發性成分存在影響。在原料相同的情況下，超臨界二氧化碳是提取黃姜姜油的最佳方法，并對其提取的姜油進行抗氧化活性研究，研究結果表明，對ABTS+自由基、DPPH自由基和羥基自由基3種自由基均有較好的清除效果。綜上分析得出，超臨界二氧化碳提取法提取的姜油的品質相對較好。