Box-Behnken模型優化油茶餅粕多酚提取工藝及抗氧化活性研究

孫曉波，韋桂鳳，王小明，張鵬，覃逸明，郭松

（廣西科技師范學院食品與生化工程學院，特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室，廣西 來賓 546199）

油茶，山茶科茶屬植物，在我國已有2 000多年的種植歷史，與油棕、油橄欖、椰子并稱為世界四大木本食用油料作物[1-2]。我國油茶種植面積已達460萬hm2，主要分布于長江以南省區[3]。油茶果由油茶籽、油茶果皮、油茶籽殼3個部分組成，以油茶籽為原料榨出的茶籽油中含有高達90%的不飽和脂肪酸，同時還含有多糖、茶皂苷、角鯊烯等多種功能性成分，長期食用有利于身體健康[4-5]。油茶籽經榨油后得到的主要副產物為油茶餅粕，如果將每年收獲的油茶籽全部用來榨油，可產生近200萬噸油茶餅粕。油茶餅粕中茶皂素、茶籽蛋白、黃酮和多酚類物質含量豐富，對大腸桿菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、柑橘青霉病菌有較好抑制效果[6]。油茶餅粕多糖具有抗血栓、降血糖、降血壓、降血脂等功效[7-8]。油茶餅粕正丁醇萃取相中的抑菌物質為黃酮苷類化合物，具有抑制黃曲霉素的效果[9]。Wang等[10]研究發現油茶餅粕皂苷在體外對人腫瘤細胞有抗增殖活性，并以肝癌H22荷瘤小鼠為實驗對象驗證了油茶餅粕中總皂苷的抗癌活性。目前，因生產工藝和生產成本限制，油茶餅粕除極少數用于提取茶皂素外，其余大部分都被當做清塘劑或肥料使用，造成資源的極大浪費。

微波輔助提取法具有耗時短、浸提液受熱均勻、節省溶劑、操作簡便等優勢被廣泛應用于多糖、黃酮、色素等有效成分的提取，但未見其應用于油茶餅粕中多酚提取的相關報道。因此，本研究采用微波輔助提取油茶餅粕中多酚，經單因素試驗和Box–Behnken模型優化油茶餅粕中多酚的最優提取工藝，并驗證其抗氧化活性，旨在為油茶餅粕資源的進一步開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅粕：市售；L-抗壞血酸（VC）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、沒食子酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、鹽酸、石油醚（均為分析純）：四川西隴科學股份有限公司；DPPH（純度>98%）：凱瑪生化有限公司；福林酚（生物試劑）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-GF101-3BS）：上海躍進醫療器械有限公司；多功能粉碎機（FW-135）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-9600）：北京瑞利分析儀器有限公司；祥鵠微波合成儀（XH-MC-1）：北京祥鵠科技發展有限公司；循環水多用真空泵（SHZ-D（Ш）：鞏義市科瑞儀器有限公司；旋轉蒸發儀（R-1001VN）：鄭州長城科工貿有限公司；臺式高速離心機（H-1850）：湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶餅粕預處理

油茶餅粕除去雜質，45℃恒溫干燥至恒重，粉碎機粉碎后過80目篩；然后將油茶餅粕粉末用石油醚回流脫脂，過濾得到脫脂油茶餅粕，再次45℃恒溫干燥至恒重，經粉碎機粉碎過80目篩后密封袋儲存備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

采用福林-酚測定法繪制沒食子酸標準曲線[11]。準確移取 0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 沒食子酸標準溶液（0.1 mg/mL）分別置于10 mL比色管中，蒸餾水稀釋定容得到不同濃度沒食子酸溶液。分別移取1.0mL上述不同濃度沒食子酸溶液于10 mL比色管中，依次加入5.0 mL蒸餾水、1.0 mL福林酚顯色劑，充分振蕩后靜置6 min，然后加入3.0 mL 7%碳酸鈉溶液，搖勻，室溫25℃下避光反應2 h，于765 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸溶液質量濃度X（mg/L）為橫坐標，以吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y＝95.938X+0.000 7，R2＝0.999 3。表明在 0.000 8 mg/mL～0.006 4 mg/mL溶度范圍內，沒食子酸溶液與其吸光度線性關系良好，適用于油茶餅粕多酚提取量的測定。

1.3.3 油茶餅粕多酚的提取及測定

準確稱取經1.3.1方法處理后的油茶餅粕粉末1.0 g，在不同微波功率、微波時間、微波溫度、乙醇體積分數、液料比條件下微波輔助提取后，減壓抽濾并定容至100 mL容量瓶作為油茶餅粕多酚提取液。準確移取1.25 mL多酚提取液稀釋定容至10 mL比色管作為待測液備用。準確移取1.0 mL上述待測液于10 mL比色管，按1.3.2方法顯色后，765 nm處測定其吸光度，平行測定3次。多酚提取量計算公式如下。

式中：c為稀釋后油茶餅粕多酚質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；m為油茶餅粕粉末質量，g；N為稀釋倍數。

1.3.4 單因素優化試驗

分別考察微波功率、微波時間、微波溫度、乙醇體積分數、液料比5個因素對油茶餅粕多酚提取量的影響。微波功率選擇 300、400、500、600、700 W；微波時間選擇 1、3、5、7、9min；微波溫度選擇 30、40、50、60、70 ℃；乙醇體積分數選擇40%、50%、60%、70%、80%；液料比選擇 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1（mL/g）。

1.3.5 響應面優化試驗

基于單因素試驗結果，結合單因素方差分析，篩選出4個對多酚提取量影響較大的因素，分別為微波功率（A）、微波時間（B）、微波溫度（C）、乙醇體積分數（D）。以上述4個因素為自變量，以油茶餅粕多酚提取量為響應值，進行四因素三水平響應面試驗，對多酚提取條件進行進一步的優化。響應面因素及水平見表1。

表1 響應面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 油茶餅粕多酚抗氧化活性評價

參考黎克純等[12]、裴斐等[13]、宋佳敏等[14]的方法并稍加以修改，對油茶餅粕多酚體外抗氧化活性進行評價，具體評價方法如下。

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測定

準確移取2.0 mL不同質量濃度的油茶餅粕多酚提取液于10 mL離心管中，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，搖勻并均勻反應30 min后，于517 nm波長處測定其吸光度A1；固定上述試驗條件，用等體積無水乙醇替代DPPH溶液，測定油茶餅粕多酚提取液本底吸光度A2；用等體積無水乙醇替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度A0，以L-抗壞血酸（VC）溶液作為對照試驗，按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.6.2 超氧陰離子自由基清除率的測定

取8支潔凈的10 mL離心管，分別加入4.5 mL 50 mmol/L（pH8.2）Tris-HCl緩沖溶液，25℃恒溫水浴20 min后立即加入1.0 mL已預熱至25℃不同質量濃度的油茶餅粕多酚提取液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻后再次將離心管置于25℃恒溫水浴4 min，取出并立即加入8 mmol/L HCl溶液1.0 mL終止反應，于325 nm波長處測定其吸光度Aβ。固定上述試驗條件，用等體積蒸餾水替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度Aα，以VC溶液作為對照試驗，超氧陰離子自由基清除率計算公式如下。

1.3.6.3 羥基自由基清除率的測定

準確移取2.0 mL不同質量濃度的油茶餅粕多酚提取液于10 mL離心管中，依次加入10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L過氧化氫溶液各2.0 mL，37℃水浴反應30 min后，于510 nm波長處測定其吸光度As；用等體積蒸餾水替換上述試驗中過氧化氫溶液，測定油茶餅粕多酚提取液本底吸光度Ac，用等體積蒸餾水替代油茶餅粕多酚提取液，測定其空白吸光度Ab。以VC溶液作為對照試驗，羥基自由基清除率計算公式如下。

1.4 數據處理

每組試驗均重復測定3次；采用Excel 2010和SPSS 19.0對數據進行統計及顯著性差異分析，采用Origin 2018繪圖，采用Design-Expert 8.0.6進行響應面試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波功率對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波功率對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖1。

圖1 微波功率對多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on polyphenols extraction amount

由圖1可知，當微波功率為300 W～600 W時，油茶餅粕多酚提取量隨著微波功率的增大而顯著增加（P<0.05）。這可能是由于增大微波功率會加速植物細胞中極性分子的振動，導致多酚類化合物溶出增多，提取量增加[15]；微波功率為600 W時，多酚提取量達到最大，最大值為39.16 mg/g；當微波功率超過600 W后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05），原因可能是微波功率過大會破壞多酚類化合物的分子結構，因而提取量降低。故選擇600 W作為最佳微波功率。

2.1.2 微波時間對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波時間對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖2。

圖2 微波時間對多酚提取量的影響Fig.2 Effects of microwave time on polyphenols extraction amount

由圖2可知，當微波時間為5 min時，油茶餅粕多酚的提取量達到最大，最大值為40.38 mg/g；與其他微波時間條件下的多酚提取量差異顯著（P<0.05）。原因可能是隨著微波時間的不斷延長，油茶餅粕中多酚類化合物溶出更完全。微波時間為5 min時，多酚類化合物已基本溶出，而過長的微波時間不僅耗能增加，且會引起其他醇溶性雜質溶出增多，導致多酚提取量下降[16]。故選擇5 min作為最優微波時間。

2.1.3 微波溫度對油茶餅粕多酚提取量的影響

微波溫度對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖3。

圖3 微波溫度對多酚提取量的影響Fig.3 Effects of microwave temperature on polyphenols extraction amount

由圖3可知，當微波溫度為30℃～60℃時，油茶餅粕多酚提取量隨著微波溫度的升高而顯著增加（P<0.05），可能原因為體系溫度升高導致分子間傳質動力增大，多酚的溶解度增大。微波溫度為60℃時，多酚提取量達到最大，最大值為40.12 mg/g；當微波溫度超過60℃后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05）。這可能是因為溫度超過60℃后，油茶餅粕中某些多酚類化合物開始分解，提取量下降[17]。故選擇60℃作為最優微波溫度。

2.1.4 乙醇體積分數對油茶餅粕多酚提取量的影響

乙醇體積分數對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on polyphenols extraction amount

由圖4可知，當乙醇體積分數為50%時，油茶餅粕多酚的提取量達到最大，最大值為42.00mg/g，與其他乙醇體積分數條件下的多酚提取量差異顯著（P<0.05）。原因主要是當乙醇體積分數低于50%時，溶劑極性較大，油茶餅粕多酚不能完全溶解；隨著乙醇體積分數的增大，多酚溶出增多；當乙醇體積分數超過50%后，溶劑極性降低導致油茶餅粕中一些其他醇溶性雜質溶出增多，與多酚形成競爭關系，降低了多酚的溶出效果[18]。故選擇50%乙醇作為最優提取溶劑。

2.1.5 液料比對油茶餅粕多酚提取量的影響

液料比對油茶餅粕多酚提取量的影響見圖5。

圖5 液料比對多酚提取量的影響Fig.5 Effects of liquid-material ratio on polyphenols extraction amount

由圖5可知，當液料比為 40∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）時，油茶餅粕多酚提取量隨著液料比的增大也顯著增加（P<0.05），原因主要是隨著液料比的不斷增大，油茶餅粕粉末與乙醇溶液接觸更加充分，多酚類化合物溶出增多，提取量增加；液料比為70∶1（mL/g），多酚提取量達到最大，最大值為42.19 mg/g；當液料比超過70∶1（mL/g）后，油茶餅粕多酚提取量開始顯著降低（P<0.05），這主要是由于液料比過大時，一些其它醇溶性物質溶解性也增大，從而抑制了油茶餅粕多酚的溶出，且液料比過大會導致溶劑的浪費[19-20]。綜合考慮，選擇70∶1（mL/g）作為最優液料比。

2.2 響應面優化

2.2.1 響應面試驗結果與分析

以油茶餅粕多酚提取量為響應值，按照Box-Behnken設計原理設計四因素三水平響應面試驗，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodology

續表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 Design and results of response surface methodology

通過Design expert 8.0.6軟件對表2數據進行二次多元回歸分析，得到油茶餅粕多酚提取量與各因素的二次多元回歸方程為Y=42.05+0.80A+1.08B+0.73C-1.09D-0.75AB+0.14AC+1.02AD+0.71BC-0.37BD-0.12CD-2.16A2-2.58B2-1.58C2-2.97D2，方差分析及顯著性檢驗見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significance test

由表3可知，模型F值為29.17，P值<0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P值為0.226 4，不顯著（P>0.05）；相關系數R2=0.966 9，說明該模型能夠很好的預測出多酚提取量。A（微波功率）、B（微波時間）、C（微波溫度）、D（乙醇體積分數）4個因素對油茶餅粕多酚提取量均有極顯著影響（P<0.01）；交互項AD有極顯著影響（P<0.01），AB、BC 有顯著影響（P<0.05），AC、BD、CD 間無顯著性影響；二次項 A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平（P<0.01）。從表3中F值大小可知，各因素影響重要性依次為乙醇體積分數＞微波時間＞微波功率＞微波溫度。

2.2.2 各因素交互作用分析

各因素間響應面和等高線圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對油茶餅粕多酚提取量的影響Fig.6 Effects of interactions factors on polyphenols extraction amount from Camellia seed cake

由圖6可知，各因素對油茶餅粕多酚提取量的影響反映在響應面曲面的陡峭程度上，響應面曲面弧度變化越陡峭，說明該因素對提取量的影響越敏感；反之則不敏感[21]。乙醇體積分數曲面較其他因素曲面陡峭，說明乙醇體積分數對油茶餅粕多酚提取量影響較為明顯。在有交互作用的影響下，微波功率和乙醇體積分數交互影響作用極顯著，微波功率和微波時間、微波時間和微波溫度交互影響作用顯著，微波功率和微波溫度、微波時間和乙醇體積分數、微波溫度和乙醇體積分數交互影響作用不顯著，這與表3分析結果一致。

2.2.3 驗證試驗

通過響應面模型預測出油茶餅粕多酚最佳提取工藝條件為微波功率610.61 W、微波時間5.50 min、微波溫度63℃、乙醇體積分數48.13%、液料比70∶1（mL/g），此條件下油茶餅粕多酚理論提取量為42.44 mg/g。考慮到試驗操作的可實施性，將工藝條件調整為微波功率600 W、微波時間5.5 min、微波溫度63℃、乙醇體積分數 48%、液料比 70∶1（mL/g），此條件下，油茶餅粕多酚的實際提取量為42.29 mg/g，相對標準偏差僅為0.42%，與理論提取量相近，說明模型有效。

2.3 油茶餅粕多酚抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定見圖7。

圖7 油茶餅粕多酚提取液對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of DPPH radicals

由圖7可知，油茶餅粕多酚、VC對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的增大而增大，當溶度為0.07 mg/mL時，油茶餅粕多酚對DPPH自由基的清除率達到83.76%，相同濃度下VC清除率為89.86%。油茶餅粕多酚濃度在0.06 mg/mL～0.07 mg/mL范圍內，對DPPH自由基清除率不存在顯著差異（P>0.05），說明繼續增大多酚濃度，清除率升高不再顯著。經擬合得出油茶餅粕多酚對DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）為0.029 mg/mL，VC的IC50為0.024 mg/mL，說明油茶餅粕多酚對DPPH自由基的清除能力與VC相近。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率的測定見圖8。

圖8 油茶餅粕多酚提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.8 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of superoxide anion radicals

由圖8可知，在低濃度范圍內，油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的清除率遠遠大于VC，隨著濃度的增大，油茶餅粕多酚、VC對超氧陰離子自由基的清除率也不斷增大且兩者差值逐步縮小；當溶度為0.8 mg/mL時，油茶餅粕多酚、VC對超氧陰離子自由基的清除率分別為83.38%、82.02%。油茶餅粕多酚濃度為0.7 mg/mL～0.8 mg/mL時，對超氧陰離子自由基清除率不存在顯著差異（P>0.05），說明繼續增大多酚濃度，清除率升高不再顯著。經擬合得出油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的IC50為0.23 mg/mL，VC的IC50為0.48 mg/mL，說明油茶餅粕多酚對超氧陰離子自由基的清除能力較VC強。

2.3.3 羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定見圖9。

圖9 油茶餅粕多酚提取液對羥基自由基清除率的影響Fig.9 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖9可知，隨著油茶餅粕多酚、VC濃度的不斷增大，其對羥基自由基的清除率也不斷增大，但油茶餅粕多酚對羥基自由基的清除率增勢較VC平緩。油茶餅粕多酚溶度為0.8 mg/mL時，對羥基自由基的清除率達到34.96%，而相同濃度下VC的清除率高達99.74%，說明油茶餅粕多酚清除羥基自由基的能力較VC弱。

3 結論

本研究基于單因素試驗結果，通過Box-Behnken模型優化油茶餅粕多酚的微波輔助提取工藝，確定微波功率600 W、微波時間5.5 min、微波溫度63℃、乙醇體積分數48%、液料比70∶1（mL/g）為最優提取工藝條件，此條件下，油茶餅粕多酚的實際提取量為42.29 mg/g，與預測值擬合效果好。在試驗所選濃度范圍內，油茶餅粕多酚對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的最高清除率分別為83.76%、83.38%、34.96%，表現出較好的體外抗氧化活性。本研究為油茶餅粕多酚的生產以及油茶餅粕抗氧化活性成分應用于功能性食品開發提供理論依據。