復合酶法提取九資河茯苓多糖及其抗氧化活性

項飛兵，熊天涵，胡書午，陳曉龍，向福，3*

（1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.黃岡市公共檢驗檢測中心，湖北 黃岡 438000；3.湖北省中科產業技術研究院，湖北 黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾寧心等功效[1-2]。研究表明，茯苓多糖是茯苓的主要活性成分，具有免疫調節[3]、抑制腫瘤[4-6]、降血糖[7-8]和抗氧化[9-10]等生理活性。地處大別山的羅田縣是著名的“茯苓之鄉”，其“九資河茯苓”于1914年獲萬國博覽會金獎，2007年批準實施地理標志產品保護。

茯苓多糖存在于細胞壁，其提取方法主要有溶劑提取法[11]、酸堿提取法[12]、超濾法[13]、微波和超聲輔助法[14]等。溶劑提取法效率低且費時；酸堿提取法程序復雜且易破壞多糖立體結構，使其生物活性受到限制；超濾法所得多糖含量較低；微波和超聲輔助提取需要較高成本，且組分更復雜難以分離。相較而言，酶法提取可催化多糖分子內糖苷鍵斷裂，降低多糖分子質量和分子黏度，提高多糖提取率和多糖活性利用率，同時縮短提取時間，降低提取成本[15]。

本試驗擬采用纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶進行協同作用，通過單因素和正交試驗探討復合酶法提取茯苓多糖的優化工藝，并評價其體外抗氧化活性，從而為大別山優質茯苓資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

九資河茯苓：湖北省羅田縣，烘干，粉碎備用；纖維素酶（>20 U/mg）、半纖維素酶（>50 U/mg）、β-葡聚糖酶（>100 U/mg）：浙江一諾生物科技有限公司；濃硫酸（分析純）：信陽市化學試劑廠；苯酚（分析純）：廣東恒健制藥有限公司；葡萄糖標準品、維生素C標準品（純度≥99%）：上海金橞生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉（均為食品級）：濰坊英軒實業有限公司；總抗氧化試劑盒（批號：20190322）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

CP413電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DEKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠；UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DHG-9147A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-500DB型臺式數控超聲波清洗器：東莞市科橋超聲波設備有限公司；精密pH試紙：上海三愛思試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線繪制及樣品中多糖含量計算

參考文獻[16]的方法，準確稱取葡萄糖標準品0.100 g，置于500 mL容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別準確量取葡萄糖標準品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于 25.0 mL 容量瓶中，加水至 4.0 mL，再分別加入5%苯酚溶液2.0 mL和濃硫酸6.0 mL，充分混合搖勻，室溫下（25℃）放置30 min后在488 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），葡葡萄糖質量濃度（mg/mL）為橫坐標（C）繪制標準曲線，回歸方程為 A=0.000 7 C-0.000 7，R2=0.999 8，表示葡萄糖濃度在40 μg/mL～200 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

酶提取液按相同方法處理，在488 nm波長下測定吸光度，按公式（1）計算多糖提取率。

式中：K為茯苓樣品的多糖提取率，%；C為樣品溶液中的多糖濃度，μg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數；V為測定液體積，mL；W為樣品的質量，g。

1.3.2 復合酶添加量正交試驗

根據前期試驗結果，以纖維素酶添加量（A）、半纖維素酶添加量（B）、β-葡聚糖酶添加量（C）為變量因子，設計L9（33）正交優化試驗確定復合酶法最佳添加量。正交試驗因素水平見表1。

表1 復合酶添加量正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test of compound enzyme dosage

稱取茯苓粉末2.00 g于錐形瓶中，分別按設計配比添加復合酶，加入pH值為5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液100 mL，攪拌均勻。置于50℃的恒溫水浴鍋中酶解90 min，置于沸水中水浴15 min滅活酶。將酶解液趁熱抽濾，用容量瓶定容到100 mL，取0.25 mL按1.3.1的方法測吸光度，計算多糖提取率。

1.3.3 酶解工藝單因素試驗

稱取3份茯苓粉末2.00 g于錐形瓶中，加入纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶各0.05 g，后續操作同 1.3.2，分別考察酶解時間（60、90、120、150、180 min）、酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃）和 pH 值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對茯苓多糖提取率的影響。

1.3.4 酶解工藝正交試驗

根據復合酶添加量正交試驗和酶解工藝單因素試驗結果，選取對多糖提取率影響較顯著的酶解時間（D）、酶解溫度（E）和pH值（F）等因素進行正交試驗設計，如表2所示。

表2 酶解工藝正交試驗的因素與水平Table 2 Factors and level of orthogonal test on enzymatic hydrolysis

1.3.5 傳統水提法制備茯苓多糖提取液

按照復合酶法的最佳酶解溫度和時間制得茯苓多糖提取液。稱取3份茯苓粉末2.00 g于錐形瓶中，加水100 mL，按照復合酶法的最佳酶解溫度和時間，在50℃條件下水提90 min，趁熱抽濾后定容到100 mL，取0.25 mL按1.3.1的方法測吸光度，計算多糖提取率。

1.3.6 總抗氧化能力評價

稀釋配制系列質量濃度的茯苓多糖提取液，并以VC溶液為陽性對照，同時將復合酶法以及水提法得到的茯苓多糖提取液濃度調整至0.3 g/L，根據總抗氧化試劑盒說明書操作，將測試管和對照管中樣液在520 nm波長處測定吸光度，并按公式（2）計算其抗氧化能力。

式中：T為總抗氧化能力，U/mL；As為測定管吸光度值；Ac為對照管吸光度值；Vt為反應液總體積，mL；Vs為取樣量，mL；n為樣品測試前稀釋倍數。

1.4 數據分析

利用正交設計助手II 3.1和Microsoft Excel 2007等軟件完成試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 復合酶比正交試驗

復合酶添加量正交優化試驗結果見表3和表4。

表3 復合酶添加量正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test for complex enzyme dosage

續表3 復合酶添加量正交試驗結果Continue table 3 Results of orthogonal test for complex enzyme dosage

表4 復合酶添加量正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal test for complex enzyme dosage

由表3、表4可知，β-葡聚糖酶對多糖提取率的影響最大，其次是纖維素酶，半纖維素酶的影響最小，原因可能是β-葡聚糖酶不僅能破壞細胞壁結構，更能將茯苓多糖中的葡聚糖聚合體降解，提高多糖提取率[17]；優化條件為A2B2C3，即纖維素酶、半纖維素酶、β-葡聚糖酶的添加量分別2.5%、2.5%和5.0%，此時茯苓多糖提取率為6.05%。

2.2 酶解工藝單因素試驗

2.2.1 酶解時間對多糖提取率的影響

酶解時間對多糖提取率的影響如圖1所示。

圖1 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.1 The effect of enzymatic reaction time on polysaccharide extraction rate

由圖1可知，多糖提取率隨著酶解時間的增加整體呈先上升后下降的趨勢，當酶解時間為90 min時，茯苓多糖提取率最高，為5.98%；繼續延長酶解時間，則茯苓多糖提取率下降。這可能是酶解時間過長引起多糖的結構發生變化[18]，導致茯苓多糖的含量不僅沒有增加反而減少，且時間過長也會使雜質溶出。因此，酶解時間以90 min為宜。

2.2.2 酶解溫度對多糖提取率的影響

酶解溫度對多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of enzymatic reaction temperature on polysaccharide extraction rate

由圖2可知，在酶解溫度45℃～50℃內，隨著溫度的增加，多糖提取率急劇上升，達到5.68%；當酶解溫度超過50℃后，多糖提取率則急劇下降。這可能是因為在50℃時，酶活性隨溫度升高而增加，多糖的溶解和擴散速率增加，從而提高多糖提取率；而當溫度過高，酶活性降低，同時高溫可能使多糖的結構發生變化[19]，導致多糖提取率急劇降低。因此酶解溫度以50℃為宜。

2.2.3 pH值對多糖提取率的影響

pH值對多糖提取率的影響如圖3所示。

圖3 pH值對多糖率提取率的影響Fig.3 The effect of pH on polysaccharide extraction rate

由圖3可知，隨著pH值從4.5增加到5.0，多糖提取率達到峰值，為6.03%；繼續提高pH值，多糖提取率呈下降趨勢。適當的pH值有利于酶的活性增加，當pH值高于5.0時，復合酶活性被破壞[20]，從而使得多糖提取率降低。故pH值以5.0為宜。

2.3 酶解工藝正交試驗

酶解工藝正交試驗結果如表5、表6所示。

表5 酶解工藝正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal test on enzymatic hydrolysis

表6 酶解工藝正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test on enzymatic hydrolysis

由表5、表6可知，酶解時間（D）對多糖提取率的影響最大，且具有顯著性；其次為酶解溫度（E），pH值（F）影響最小；最優工藝條件為D2E2F2，即酶解時間90 min、酶解溫度50℃、pH值5.0。

2.4 酶解工藝驗證試驗

在纖維素酶、半纖維素酶、β-葡聚糖酶的添加量分別2.5%、2.5%和5.0%，酶解時間90 min、酶解溫度50℃、pH 5.0條件下，重復提取6次，茯苓多糖的平均提取率為（6.13±0.45）%，高于表5中的最高多糖提取率5.93%。

根據優化的酶解溫度和時間，采用水提法在50℃條件下水提90 min，測得茯苓多糖提取率為（1.47±0.20）%，只有復合酶法提取率的23.98%。此外，陳莉等[21]采用熱水浸提法所得茯苓多糖的提取率為2.29%，采用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶的復合酶酶解法的提取率為3.56%，采用酶解+熱水浸提法把提取率提高到5.31%，均低于本試驗優化得到的茯苓多糖提取率。一方面可能是由于茯苓原料的區別，另一方面也可能是纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶對茯苓多糖提取的協同作用較纖維素酶、蛋白酶、果膠酶3種酶更具優勢。

2.5 總抗氧化能力評價

以VC為對照，測定復合酶法所得茯苓多糖提取液不同濃度下的總抗氧化能力如圖4所示。

圖4 茯苓多糖和VC的總抗氧化能力Fig.4 The total antioxidant activities of poria polysaccharide and VC

由圖4可知，Vc溶液的總抗氧化能力在0.2 g/L～0.6 g/L濃度時呈明顯的線性增長關系，增加至0.8 g/L時則趨于穩定；茯苓多糖溶液的總抗氧化能力則在濃度增加到0.8 g/L后繼續增加。表明此總抗氧化能力測試方法可行，纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶3種酶協同提取的茯苓多糖溶液具有抗氧化活性，且隨著多糖濃度增加，總抗氧化能力越強；但從受試濃度范圍看，茯苓多糖溶液的總抗氧化能力弱于相同質量濃度的VC溶液。

為進一步評價茯苓多糖提取液的抗氧化活性，將復合酶法和水提法得到的茯苓多糖提取液濃度調整至0.3 g/L，測定總抗氧化能力分別為（2.63±0.41）U/mL和（0.90±0.21）U/mL，即復合酶法所得茯苓多糖提取液的總抗氧化能力是水提法的2.9倍。推測是由于β-葡聚糖酶將茯苓多糖中的葡聚糖聚合體降解為低分子片段，且保持其立體結構而生物活性高[17]，從而提高了茯苓多糖的抗氧化能力。

3 結論

以大別山“九資河茯苓”為對象，建立了纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶3種酶協同提取茯苓多糖的優化工藝，即纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶的用量分別為2.5%、2.5%和5.0%、酶解時間90 min、酶解溫度50℃、pH 5.0。此條件下，茯苓多糖提取率為6.13%，為相同條件下水提法的4.17倍，其總抗氧化能力是水提法的2.9倍。該方法條件溫和，操作簡單，且多糖提取率和抗氧化活性優勢明顯，可用于大別山地區九資河茯苓多糖的工業化制備。