超高效液相色譜-串聯質譜法測定紅美人中8種酚酸化合物

張今君，夏慧麗，方如意

（臺州市食品檢驗檢測中心，浙江 臺州 318000）

紅美人又名愛媛28，是引自日本的雜柑類品種[1]，近年來在浙江、福建、江西等多地引種。在試點栽培過程中發現，紅美人在結果習性、外觀、品質等方面表現較為突出，成為各地主推的柑橘新品種之一。目前紅美人在市場定價、果品質量存在一定的差異，人們對紅美人果品質量的判斷也大都停留在外觀、口感等感官評價上，隨著社會發展和生活水平的提高，消費者除了追求口感品質，對功能性品質的需求日益增加。目前與紅美人相關的文獻多集中在不同產地的引種表現及栽培技術的研究[2-5]，而有關紅美人中功能性成分研究甚少，對于果品等級劃分缺乏科學評價依據。

酚酸是結構中帶有酚類基團和有機羧酸官能團的化合物[6]，具有潛在的抗氧化、抗病毒、抗菌消炎等多種生物活性[7-9]，是紅美人品質指標之一，也是重要的功能性成分。因此，測定及分析紅美人中酚酸物質含量及組成，對評價紅美人果實品質、挖掘功能性成分具有重要意義。目前柑橘中酚酸的檢測方法主要是高效液相色譜法[10-13]和超高效液相色譜法[14-15]，高效液相色譜法具有易操作、靈敏度高和穩定性好等特點，但存在溶劑用量大、分離度差、耗時長等缺點；超高效液相色譜法采用超高壓技術，具有高效、分離度高的優勢，但不能對所檢物質準確定性。超高效液相色譜串聯質譜法既能發揮色譜法的高分離能力，又能發揮質譜法的高鑒別能力，更適用多種酚酸的定量定性分析[16-21]。本文以浙江省6個產區的紅美人柑橘為研究對象，采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定紅美人中酚酸化合物的含量，分析酚酸化合物的組成和含量，以期為紅美人品質評價及功能性成分挖掘提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅美人柑橘：來源于寧波象山、麗水蓮都、衢州衢江、臺州黃巖、溫嶺和臨海6個主要生產基地。分別從每個基地隨機采集無病蟲害、無機械損傷且成熟度基本一致的樣品6份，-18℃冷凍保存。

沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸等標準物質：加拿大多倫多研究化學品公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：美國Thermo Fisher公司；鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；Oasis HLB 小柱（6 mL/200 mg）：美國Waters公司。

1.1.2 儀器與設備

QTRAP 4500三重四極桿-線性離子肼質譜系統：美國AB Sciex公司；UPLC液相色譜系統：日本島津公司；Allegra X-30R冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；KS4000ic可控溫振蕩箱、VORTEX 3渦旋混勻器：德國IKA公司；2150 TH超聲波儀：上海安譜實驗科技股份有限公司；PR 1602 ZH/Z電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制

準確稱取每種標準品各20 mg（精確至0.1 mg），分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為2 mg/mL標準儲備液（-18℃保存）?；旌蠘藴手虚g液：準確吸取上述標準儲備液各25 μL置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，配制成濃度均為5 μg/mL的混合標準中間液。配制合適濃度的標準工作溶液，以標準溶液濃度為橫坐標，化合物峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取紅美人果肉2.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol/L EDTA），40℃避光振蕩水解2 h，離心吸取10 mL，用鹽酸調節pH值至2，提取液轉入經過預先處理的Oasis HLB小柱，棄去濾液，用5 mL甲醇分兩次清洗固相萃取小柱，加甲醇定容至5.0 mL，混勻，過0.22 μm濾膜，上機測試。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm），柱溫 35℃；流速 300 μL/min；進樣體積5 μL；流動相：A為含0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of condition

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI源）；負離子掃描（ESI-）；多反應監測（multiple re action monitoring，MRM）；電噴霧電壓（ion spray，IS）5 500 V；霧化氣壓力（gas of nebulizer，GS1）0.34 MPa；輔助氣壓力（gas of heater，GS2）0.34 MPa；氣簾氣壓力（curtain，CUR）0.24MPa；離子源溫度（temperature，TEM）550℃，各化合物定性離子、定量離子對及其碰撞能量等參數見表2。

表2 化合物的質譜參數Table 2 The mass spectrum parameters of compound

續表2 化合物的質譜參數Continue table 2 The mass spectrum parameters of compound

1.3 數據處理

譜圖在SCIEX OS-Q軟件上處理，采用離子比及保留時間進行定性確證，外標法計算各組分含量。數據使用Micro-softExcel 2007軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

參照NY/T 3290-2018《水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的測定液質聯用法》[16]對紅美人中的酚酸進行檢測。紅美人中游離型、游離酯型、結合酯型3類酚酸均有檢出，其中游離酯型、結合酯型酚酸需水解提取。本文通過比較不同濃度、不同體積NaOH溶液優化水解條件。取紅美人樣品9份，分別加入20 mL 2、4、6 mol/L NaOH溶液，每個濃度測定3次，結果見圖1。

圖1 不同濃度NaOH溶液中酚酸的含量Fig.1 Content of phenolic acids in different concentration of NaOH solution

由圖1可知，沒食子酸、原爾茶酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸在2 mol/L NaOH溶液水解時含量略高，對羥基苯甲酸、香草酸、芥子酸在6 mol/L NaOH溶液水解時含量略高，各目標化合物在3個濃度下含量變化不大，綜合考慮選擇2 mol/L NaOH溶液進一步考察不同體積NaOH溶液對水解效率的影響。

稱取紅美人樣品 15份，分別加入 5、10、15、20、25 mL 2 mol/L NaOH溶液，每個體積測定3次，按1.2.2方法對樣品進行處理，各目標物結果見圖2。

圖2 不同體積NaOH溶液中酚酸的含量Fig.2 Content of phenolic acids in different volume of NaOH solution

由圖2可知，在5 mL～20 mL范圍內沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸測定含量隨NaOH溶液體積增加，在20 mL時含量最高，因此本文選擇2 mol/L、20 mLNaOH溶液對樣品進行水解提取。

2.2 儀器條件優化

2.2.1 色譜條件

選用HSS T3色譜柱對9種酚酸進行分離[16-17]。流動相通過對比乙腈/水、乙腈/0.1%甲酸水、乙腈/0.01%甲酸水3種類型進行比較優化。結果顯示，在乙腈/水體系中所有組分在3 min出峰，保留時間短且峰型拖尾；在乙腈/0.01%甲酸水、乙腈/0.1%甲酸水流動相中各目標化合物分離良好且峰型尖銳。這是因為酚酸化合物中含有-OH和-COOH，加入甲酸能有效調節酚酸化合物解離，改善峰型，提高化合物在色譜柱上的保留。另外酚酸化合物負離子掃描模式下，水中甲酸增加至0.1%時會導致各目標化合物信號降低，因此本試驗選擇乙腈/0.01%甲酸水對樣品進行洗脫。3種不同流動相條件下的總離子流圖見圖3。

圖3 3種不同流動相條件下的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms under 3 mobile phases

2.2.2 質譜條件

將0.1 μg/mL各標準溶液經蠕動泵以7 μL/min流速進入ESI源進行質譜分析。通過Q1全掃模式獲得分子離子峰，用子離子模式對分子離子峰進行分析，從打碎的離子中選取兩個特征離子作為定性和定量離子。用MRM掃描模式優化去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能量（collision energy，CE）值，使得定量與定性離子強度響應最大，優化后的9種酚酸化合物質譜參數（表2）。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限、精密度、穩定性

配制不同濃度梯度的酚酸標準溶液，按照1.3.3儀器條件上機測試，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程和相關系數；以3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限和定量限。取200 μg/L的混合標準溶液連續進行6次，計算峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度；取同一份混合標準溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測試，計算峰面積RSD，考察穩定性。具體結果見表3。

表3 9種酚酸的相關系數、檢出限、定量限、精密度及穩定性Table 3 Correlated coefficient、precision、stability、detection and quantification limit of 8 kinds of phenolic acids

由表 3可知，9種酚酸在 5 μg/L～5 000 μg/L 濃度范圍內線性良好，相關系數（r）≥0.999 1，檢出限濃度范圍為0.05 μg/L～0.73 μg/L，定量限的濃度范圍為0.17 μg/L～2.44 μg/L。9 種酚酸化合物的精密度為1.3%～3.0%，穩定性為1.9%～3.9%。

2.3.2 回收率及重復性

稱取6份已知含量的樣品2.00 g，添加5.0 μg/g阿魏酸及0.5 μg/g另外7種酚酸標準溶液，按照試驗方法進行測定并計算目標化合物的回收率和RSD，具體結果見表4。

表4 8種酚酸回收率及重復性Table4 Recovery rate and repeatability of 8 kinds of phenolic acids

由表4可知，8種酚酸化合物回收率為85.7%～103.9%、重復性為0.92%～5.28%。

2.4 6個產地紅美人果肉中酚酸的組成和含量

各產地紅美人中8種酚酸含量見表5。

表5 6個產地紅美人中酚酸的組成和含量Table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

續表5 6個產地紅美人中酚酸的組成和含量Continue table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

由表5可知，樣品中均檢出沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸，8 種酚酸的總量為 68.82 μg/g～98.96 μg/g，其中阿魏酸含量最高，為 38.02 μg/g～53.79 μg/g，占總酚酸50%以上，綠原酸含量次之，為 15.84 μg/g～25.90 μg/g，其余6種酚酸含量較低，分別為沒食子酸0.05 μg/g～0.12 μg/g、原爾茶酸 1.01 μg/g～1.81 μg/g、對羥基苯甲酸0.77 μg/g～1.38 μg/g、香草酸 1.43 μg/g～2.72 μg/g、對香豆酸 6.38 μg/g～11.00 μg/g、芥子酸 2.00 μg/g～6.95 μg/g。分析發現，各產地紅美人中酚酸組成比例基本穩定，其中阿魏酸占比均在51.10%～57.51%，綠原酸占比均在22.29%～27.86%。

3 結論

研究建立了超高效液相色譜－串聯質譜同時測定紅美人中8種酚酸的檢測方法，方法采用NaOH溶液水解提取樣品中游離酯型、結合酯型酚酸，使紅美人中酚酸測定更加全面。該方法準確可靠、靈敏度高，適合紅美人中酚酸的定性和定量檢測，可推廣應用于其他柑橘中酚酸含量的測定。

利用建立的方法對浙江省6個產區的紅美人進行測定，樣品中均檢出沒食子酸、原爾茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對香豆酸、阿魏酸及芥子酸，酚酸含量豐富，其中阿魏酸含量最高，綠原酸次之。酚酸的組成和含量分析為后續紅美人功能成分的開發利用提供數據參考。